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1、灰度值和光密度值在免疫组化定量分析灰度值和光密度值在免疫组化定量分析免疫组化技术现在是很成熟的方法，但是对免疫组化照片的分析并没有一个权 威的说法。现在可以查到无数篇应用像分析来分析免疫组化的文献，但几乎 没有哪一篇能详细地叙述分析的过程与方法。首先，免疫组化的样品应该是用对免疫组化产物染，同时用苏木对细 胞核进行复染。镜下观察样品，细胞核被染上了蓝，胞浆间有黄（强阳性 的地方会呈现棕黄）。居然经常能看到其他颜的免疫组化照片，这肯定是 样品制作过程中有了差错。用肉眼观察免疫组化切片的结果只能是定性的，不准确的。使用像分析软件 定量地（至少是半定量）对照片测量出一个数值来自然比用肉眼看更准确。切
2、片上阳性反应物量是由片上黄染的深浅与面积一起表现的。所以最终 要测量的就是片上黄部分的累积光密度（IOD），这是个没有单位的相对数 值。就是把片上每个黄的象素点的强度值全部累加起来得到的值。IOD 除以一个适当的面积，就是一个平均光密度。这个面积可以就是照片的面积， 也可以是照片上一个组织区域的面积，或者是有黄的区域的面积。必须根据 切片的实际情况来适当选择。对于细胞核的免疫组化切片，在细胞核上，由于有蓝复染，所以需要另一种 分析方法。将另作讲解。这张照片曝光稍大。但仍能表现出免疫组化的黄染与细胞核的蓝染。在拍摄照片时，需要注意的地方是：.所有的照片必须以同样的显微镜环境与拍摄条件来拍摄。在拍
3、摄照片时，要 保持显微镜光源亮度的稳定，用同样的曝光时间拍摄照片。在更换视野或切片时，除了对焦距这个操作外，其他所有的操作都不能有变化。强阳性的样品就 是暗的黄的，弱阳性的样品则亮一些，阴性样品就是一片白。这样才能测量出 正确的密度值。.曝光的选择：试拍摄一张空照片，看一下白背景的亮度，应该在附 近。过低过高都不好。3.注意相机白平衡：如果使用的是专业 CCD 相机，会有校正白平衡的功能，此 时应对空视野进行白平衡校正。如果是普通的数码相机，要关闭自动白平衡功 能。或者选择阳光模式。避免拍摄的照片因为偏而偏蓝或偏黄。4.很多显微镜都是同时有荧光附件的，在拍摄荧光照片时要加上滤光片，注意 有时候
4、这些滤光片会忘了移开，结果拍摄的照片就会严重偏。正确地拍摄照片是像分析的基础，以后的各项应用实例中往往都会先介绍如 何拍摄照片。像分析方法：1.校正片光密度分析免疫组化照片，第一步就是要校正光密度。照片上黄点的亮度数值是灰 度，黑为 0，白为 255.这与免疫组化强度是相反的。深深的点，数值应 该更大才对。在理论上，片上的灰度与样品阻挡光线的物质光密度是一个指 数关系，对于白的点，对应样品透光率为 100%，光密度为零。对于黑的 点，对应样品透光率为 0，光密度为无穷大，但实际上把这个光密度值定为 2.0.校正光密度值就是把程序的光密度值设置成这样的坐标。在 carliberation int
5、ensity 的窗口里点 new,然后选择 std option density.把鼠标放在片上最白的地方，然后看程序窗口下方的状态栏，会有显示该点 的三各自的灰度值，在其显示的数值中间选择一个差不多的整数，比如 230， 或 220，作为背景扣除值。操作方法是：点 option 按纽，在弹出的小窗口中的 incident level 中把默认的 255 改为 230 或 220.返回就可以了。最后在窗口右上方点一下 system 把这个校正作为系统光密度值应用于所有片。 这个设定被默认地命名为 intensity cal 0 。光密度校正的窗口不要关闭，可 以移到边上放着随时检查。有时候新照
6、片未必会应用上，要重新调出刚才设定 的 intensity cal 0.2.选。在 segmentation 中使用 HSI 模式，选择 H:0-30,S:0-255,I:0-230.然后点 file - save。HSI 的选择范围是可以根据片情况作微调的。保存这个选设置。 一般放在片的保存文件夹里。默认的保存文件是 rgb24.rge。3.设置分析环境。一个是 select measurement。要选择 IOD。另外默认的选择 area 都是要测量的。 对 area 的过滤值，默认为 10，实际上还可以大点，设置到 25 甚至 50 也行，可 以把那些小的杂质点去掉。另一个是 optio
7、n:outline :filledlabel style :nonedark background on sample :nosmoothing=1filled hole:onclean border : none4.保存分析环境。在 count/size 窗口中点 file save settings。保存环境设置文件。5 测量用 irregular 工具画出测量区域。这里很关键的一点就是如何画这个测量区域。最普通的情况下，要测量整张照片的光密度，就不必画这个测量区域了。此时 会测量照片上全部被选中的黄的光密度总和（IOD SUM），面积就是照片的面积。如果你拍摄的照片上，有个角正处于切片边
8、缘，没有细胞，这就需要把这个角 上的空白面积给扣掉了，此时画的“测量区域”就应该沿着样品的边缘来画。另一种情况是，要测量一个癌巢里的蛋白表达，边上正常组织上的表达不算。 这时候就要沿着这个癌巢的边界画这个“测量区域”。点 count 按纽。完事。测量数据在 view statistics 窗口中，读取 IOD SUM 数 值，作为这张照片的累积光密度值。其他的数值都是没用的。如果你用 irregular 工具画了一个“测量区域”，那点 count 时，程序会只测 量“测量区域”内的 IOD。外面的不管。在测量数据中显示的 area 是黄部分的面积。在很多情况下，这个面积值意义 不大。6.测量面
9、积。通常我们需要测量的是一个平均光密度（mean density）而不是积分光密度 (IOD)。上一步已经测量了 IOD，现在就要测量 area 了，再说一遍，上一步的测 量数据里的 area 在通常情况下并不是正确的 area。如果测量的是整张照片，area 就是照片的面积。如果用 irregular 画了“测量 区域”，area 就是这个测量区域的面积。此时只要在 count/size 窗口中点 edit - convert AOI to object，然后就能在测量数据窗口中看到测量面积了。 此时还能看到另一个 IOD 值，这个值是不能用的，它包括了蓝细胞核的光密 度。7.数值处理：对每
10、一张照片，要测量一个 IOD SUM ，如果选择了测量区域，还要测量一个 area。这张照片的测量值一般是平均光密度，它反映了这张照片上免疫反应物的表达 强度。mean density = (IOD SUM) / area在测量整张照片的时候，可以只测量 IOD SUM ，在这种情况下，所有照片的面 积都是相等的。mean density 与 IOD 都是个相对值，所以是没有单位的。其实 OD 值本身就是 个比例值。这个词在分光光度计上常用，意思是 optical density通常我们有两组实验对象，实验组与对照组，每组有十来个样品，各拍摄几张照片。每个样品拍摄的几张照片测量的 mean d
11、ensity 再作一次平均，作为这个样品的 mean density.一个实验组的几个样品测量值可以计算其平均值与标准差，或者直接用 T 检验 去统计两组的统计学差异。把一张照片的测量值当作一个数据也是可以的。再次强调，一张照片只测量一个 IOD 值或 mean density 值，作为这张照片的测 量数据。statistics 窗口中的其他统计数值不必管它。8.批量测量照片：测量一组照片时，首先用一张比较典型的照片按上面步骤测量。然后在测量其 他照片时，必须用这些测量条件来测量。因为已经保存了背景校正、选文件 与测量环境文件，所以在测量时要直接调用这些设置文件。8.1 把第一张照片最小化，不
12、要关闭。8.2 打开第二张照片，或者一次打开全部照片，激活一张。8.3 检查光密度校正窗口，确认应用了光密度校正。8.4 在 count/size 中 load settings，调出环境设置文件。8.5 点 select color 调出 segmentation 窗口。确认处于 Histograph 及 HSI 模 式下。再调出选文件。8.6 需要时用 irregular 画测量区域。8.7 点 count 测量 IOD，记录数据（点 statistics 中的 DDE to excel），再点 convert AOI to object 测量面积，再记录数据（还是点 statistics
13、 里的 DDE to Excel，注意，这是两次向 excel 输送数据，所以事先要在 DDE option 中选 择 append data to end，否则后面的数据会冲掉前面的）。8.8 关闭片，再测量下一张。9.上面的测量步骤有个系统误差。在测量 IOD 的时候是直接测量彩照片的 IOD，虽然对测量结果影响不大，如果希望测量得细致一点，就需要增加一个将 彩片转换成黑白片的步骤。方法是：在选择完颜后（就是上面的 8.5 之后），在 segmentation 窗口里的 view 下 面选择 transparant on white.可以看见片上除了黄外，其他地方都变成白了。然后点 create preview image 复制这张效果片。转换这张片为 8 位灰度格式（grey scale 8）。在这张灰度片上用 irregular 画测量区域（就是按照上面的 8.6 以后继续作） 。对灰度片还要再作一次选，此时 select color 按纽会变成 select ranges，只有一个 I 可以选择，此时选择范围是 0-240 。这回的 IOD 测量值与稍大一点。这是正确的光密度测量值。但操作上增加了很 多步骤。也不便于编制宏操作进行测量。
