发酵工艺控制

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1、发酵工艺控制发酵工艺控制 2.1 概述 一. 发酵体系的主要特征发酵体系的主要特征 1. 细胞内部结构和代谢反应的复杂性 2. 细胞所处环境的复杂性 3. 过程系统状态的时变性 及参数的多样性和复杂性 影响因素多，有的因素未知，主要影响因素变化。 发酵水平主要取决于：发酵水平主要取决于：生产菌种的特性；对工艺条件的控制（适合程度） 必须了解：菌体的生理代谢规律 工艺条件对发酵过程的影响及其控制 发酵过程的有关变 化规律 常规发酵的工艺控制参数：常规发酵的工艺控制参数：温度、pH、搅拌转速与功率、空气流量、罐压、液位、补料速 率及补料量等。 二二. 发酵过程的参数检测发酵过程的参数检测 1.直接

2、状态参数直接状态参数 指能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数 包括：pH、DO、溶解 CO2、尾气 O2、尾气 CO2 、黏度、基质和产物浓度、菌体浓度 （OD、DCW、湿重）等 参数的检测参数的检测 在线检测 各种传感器： pH 电极、 DO 电极、温度电极、液位电极、泡沫电极 尾气分析仪：测尾气 O2 和 CO2 含量 离线检测 分光光度计、pH 计、温度计、气相色谱（GC)、液相色谱（HPLC)、色质连用 （GC-MS)等 2.间接状态参数间接状态参数 指利用直接状态参数计算求得的参数 包括：比生长速率 、摄氧率 OUR、 CO2 释放率 CER、呼吸商 RQ、氧的得率系数 YX

3、/O 、氧体积传质系数 KLa、基质比消耗速率 QS、产物比生成速率 Qp 等 综合各种状态参数，获得代谢过程的各种信息，从而对发酵过程做出相应的调整和控制，综合各种状态参数，获得代谢过程的各种信息，从而对发酵过程做出相应的调整和控制， 以获得最经济的发酵生产。以获得最经济的发酵生产。 三三. 发酵过程的代谢调控和优化发酵过程的代谢调控和优化 1. 代谢调控代谢调控 以代谢（流）的调节最重要 调节酶的合成量，称为“粗调粗调” 调节酶的催化活性，称为“细调细调” 工艺控制和过程优化的实质工艺控制和过程优化的实质，就是利用各种方法和手段，使细胞的外部和内部环境最适合最适合 基质和能量流向产物合成的

4、生物途径基质和能量流向产物合成的生物途径，以获得最大的产量。 2. 发酵过程优化的一般步骤发酵过程优化的一般步骤 确定反映发酵过程的各种理化参数及其检测方法理化参数及其检测方法 研究这些参数的变化对发酵过程的影响参数的变化对发酵过程的影响及其机制，获得最佳的范围和最适的水平 建立数学模型数学模型定量描述个参数间随时间的变化关系，为过程优化控制提供依据为过程优化控制提供依据 通过计算机实施在线自动检测和控制计算机实施在线自动检测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发实现发 酵过程的最优控制酵过程的最优控制 2.2 基质浓度对发酵的影响及其控制 先进的培养基组成是充分支持高产、稳产和

5、经济的发酵过程的关键因素之一。 一一. 基质种类基质种类 一般包括：碳源、氮源和无机盐碳源、氮源和无机盐 前体前体二二. 基质（原料）的质量基质（原料）的质量 随产地和生产工艺而异 须保证稳定的原料质量 尤其对有机碳源和氮源，经多次实验而 定 三三. 基质浓度对发酵的影响基质浓度对发酵的影响 每一种基质都有一个适宜的浓度范围 基质浓度太低基质浓度太低 影响细胞的生长，不能保证足够量的菌体进行生产；延长发酵时间，降低生 产效率 基质浓度太高基质浓度太高 菌体生长太旺盛，发酵液黏度很大，KLa 很小，DO 很低，影响发酵正常进 行；影响产物形成：如酵母利用葡萄糖进行培养，葡萄糖浓度太高， 将进行无

6、氧发酵，产生乙醇，即为 crabtree 效应 又如葡萄糖氧化酶（葡萄糖氧化酶（GOD)发酵发酵中：低浓度下：诱导作用诱导作用 高浓度下：分解代谢物阻遏作用分解代谢物阻遏作用浓度由 8%6%，酶活提高 26% 以铵盐为氮源发酵铵盐为氮源发酵： NH4+浓度过高，产生铵离子效应铵离子效应，影响生长和合成 基质浓度的控制基质浓度的控制 初始培养基中：基质浓度适宜（由实验而定） 发酵过程：通过补料操作补料操作来控制基质浓度 应根据菌体特性、工艺条件要求和发酵过程中代谢的具体情况，确定补料方式、速率和补补料方式、速率和补 料量料量。 2.3 灭菌情况 灭菌温度高，时间长，对培养基破坏作用越大，影响菌体

7、生长和产物合成。 如葡萄糖氧化酶（GOD)发酵中，灭菌温度比灭菌时间对产酶的影响更大。 一些易被高温破坏的成分如葡萄糖葡萄糖、前体等应该分消分消。 2.4 种子质量的影响 种子的质和量种子的质和量对菌种生长的快慢和产物的合成存在重要的影响。 1. 接种菌龄接种菌龄 菌龄菌龄 指在种子罐中培养的菌体从开始培养至接种到下一级种子罐或发酵罐的这段培养时间 适宜菌龄适宜菌龄 以对数生长期的后期，即培养液中菌浓接近高峰时的种子较适宜 菌龄过小菌龄过小 发酵前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟 菌龄过大菌龄过大 菌量较多，生产能力下降，菌体过早自溶 最适的菌龄须多次实验，由发酵的结果而定

8、最适的菌龄须多次实验，由发酵的结果而定 2. 接种量接种量 接种量接种量 指接（移）种的种子液体积与培养液体积之比 适宜的接种量适宜的接种量 与菌体的特性（生长繁殖速度）及发酵工艺有关 常用接种量：5%10%抗生素生产：20%25%，甚至更大 较大的接种量：可缩短生长达到高峰的时间，使产物合成提前，减少杂菌生长的机会较大的接种量：可缩短生长达到高峰的时间，使产物合成提前，减少杂菌生长的机会 接种量太小接种量太小 生长延迟期延长， 发酵周期长，产物形成较迟，生产效率降低 接种量过大接种量过大 生长过快， 发酵液黏度增加 ， 溶氧不足， 影响产物合成 2.5 温度对发酵的影响及其控制 菌体生长和产

9、物合成都是在各种酶的催化下完成的，温度是保证酶活性的重要条件，因此菌体生长和产物合成都是在各种酶的催化下完成的，温度是保证酶活性的重要条件，因此 在发酵过程中维持稳定而合适的温度就显得十分重要。在发酵过程中维持稳定而合适的温度就显得十分重要。 一一 影响发酵温度的因素影响发酵温度的因素 1 发酵热发酵热 发酵热是指发酵过程中释放的净热量，Q 发酵 J/(m3h) Q 发酵=Q 生物+Q 搅拌Q 蒸发Q 显Q 辐射生物热生物热 Q 生物 ：菌体在生长繁殖过程中产生大量的热称为生物热；由生物大分子（碳 水化合物、脂肪、蛋白质）分解为小分子（CO2、NH3、H2O 等）而产生的；一部分用于 合成高能

10、化合物、菌体合成、维持代谢、产物合成，其余以热的形式释放出来； 搅拌热搅拌热 Q 搅拌：好气培养中由于搅拌作用而产生的热量 蒸发热蒸发热 Q 蒸发和显热和显热 Q 显：由于发酵液中水分的蒸发带走的热量为 Q 蒸发由尾气的排出带走的热量为显热 辐射热辐射热 Q 辐射：由于罐内外温差，发酵液中通过罐体向外辐射的热量 抗生素生产的最大发酵热： 300070004.19kJ/(m3h) 为了维持一定的温度，须采取相应的措施：在蛇管蛇管或夹套夹套内，通入冷却水（或热水）进行 冷却（或加热） 。 影响生物热的因素影响生物热的因素 1 培养基成分越丰富 2 菌体对基质的利用速率越大 3 发酵过程中代谢越旺盛

11、生物热越大生物热越大 抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号，说明抗生素合成时菌体的代谢十分旺盛 生物热与呼吸强度存在对应关系 二二 温度对菌体生长的影响温度对菌体生长的影响 最适生长温度和耐受范围各异，跨度一般为 30 1 温度对菌体生长的影响温度对菌体生长的影响 温度对菌体生长和死亡的影响温度对菌体生长和死亡的影响 菌体的生长速率： dX/dt=XX (2-1) 式中 为比生长速率，为比生长速率， 为比死亡速率为比死亡速率 温度对 和 的影响可以用 Arrennius 方程方程表示： ln=lnAEa/RT (2-2)ln=lnAEa/RT (2-3) 式中 A 和 Ea 分别为 Arre

12、nnius 常数和活化能，R 和 T 分别为通用气体常数和绝对温度 典型活化能 Ea： 5070kJ/mol 死亡活化能 Ea： 300380kJ/mol 若发酵温度从 T1 提高至 T2（温差T= T2 T1 ） ，菌体的 的变化可由式(2-2)得：ln（1/2）=Ea/R（1/T11/T2）=（Ea/R）T/（T1T2） (2-4) 同样可得： ln（1/2）=（Ea/R）T/（T1T2） (2-5) 由于 EaEa，因此比死亡速率比死亡速率 的变化大于比生长速率的变化大于比生长速率 的变化，即温度对具有高活的变化，即温度对具有高活 化能的死亡速率的影响远大于具有较低活化能的生长速率；化能

13、的死亡速率的影响远大于具有较低活化能的生长速率； 菌体的生长必须保持在一定的温度范围保持在一定的温度范围，若超过这个范围，菌体就生长不好，甚至无法生 长 又如青霉素发酵中： 生长的 Ea=34kJ/mol合成的 Ea=112kJ/mol 说明青霉素合成速率对温度更敏感，青霉素合成速率对温度更敏感，可以采用变温发酵来提高青霉素的合成； 温度对得率系数温度对得率系数 YX/S 的影响的影响 在酵母的培养中：温度上升，得率系数 YX/S 随之下降； 维持所需的能量增加； 维持活 化能：5070kJ/mol； T 最大转化率略低于 T 最适生长 温度对细胞代谢的影响温度对细胞代谢的影响 温度升高， 增

14、大，生物大分子的比例也增大 重组蛋白生产： T 由 30 升高到 42 ，以诱导产物的形成。 温度对细胞脂质成分的影响温度对细胞脂质成分的影响温度降低， 脂质成分不饱和程度增加， 不饱和脂肪酸的含量增大三三 温度对发酵的影响温度对发酵的影响 温度对生长和生产的影响是不同温度对生长和生产的影响是不同T，酶反应速率酶反应速率 生长代谢加快，生产期提前 T，酶易因过热而失活酶易因过热而失活， 菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量 T 变化，改变发酵液的物理性质发酵液的物理性质， 氧的溶解度 基质的传质速率 菌体对养分的分解和 吸收速率 影响产物的合成 温度还会影响生物合成的方向温度还会影响生物合

15、成的方向 金色链霉菌培养中： T 30，合成金霉素T 35，合成四环素 利用温度对代谢的调节作用利用温度对代谢的调节作用 氨基酸合成途径的终产物对第一个酶具有抑制作用，且：低温（20）下生长温度（ 37）下 抗生素发酵中：后期降低温度， 使蛋白质和核酸合成途径关闭早些 代谢转向产物合成 途径 四四 最适温度的选择最适温度的选择 根据菌种及生长阶段选择根据菌种及生长阶段选择 最适生长温度与最适生产温度往往不同最适生长温度与最适生产温度往往不同 微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同 在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的 呼吸与代谢，使菌生长迅速 黄原胶发酵： 前期生长温度：2427；中后期黄原胶形成温度：30332025h 进行变温，产胶量提高 20% 根据培养条件选择根据培养条件选择 最适温度的选择应参考其他发酵条件，灵活掌握最适温度的选择应参考其他发酵条件，灵活掌握 供氧条件供氧条件 供氧较差温度降低生长速率小发酵液较稀提高 DO 培养基的成分和浓度培养基的成分和浓度 较稀或较易利用温度提高养分耗