常用蛋白还原剂和变性剂

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1、常用蛋白还原剂常用蛋白还原剂1DTT中文名称为二硫苏糖醇（Dithiothreitol，简称为 DTT） ，是苏糖醇的 C-1 及 C-4 位羟基 置换成巯基的化合物。在生化反应中用做还原剂，保护蛋白质或酶中的巯基不致氧化而失 活。也常用于还原蛋白质分子中的二硫键等。 DTT 是一种小分子有机还原剂，化学式为 C4H10O2S2。其还原状态下为线性分子， 被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。二硫苏糖醇的名字衍生自苏糖（一种四碳单糖） 。 DTT 的异构体为二硫赤糖醇（DTE） ，即 DTT 的 C3-差向异构体。 DTT 也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形

2、 成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但 DTT 往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不 可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂， 如 6M 盐酸胍、8M 尿素或 1% SDS） 。反之，根据 DTT 存在情况下，二硫键还原速度的 不同，可以判断其包埋程度的深浅。2.-巯基乙醇英文名称：-Mercaptoethanol，化学式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一种具有 特殊臭味的无色透明液体，易燃、易溶于水和醇、醚等多种有机溶剂。-巯基乙醇(又称为 2-巯基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羟基乙硫醇、-硫醇代乙醇）是 一种有机化合物，其化学式为 HOC

3、H2CH2SH，英文通用缩写为 ME 或 -ME。它兼具乙 二醇（HOCH2CH2OH）和乙二硫醇（HSCH2CH2SH）的官能团，为挥发性液体，具有较 强烈的刺激性气味。-ME 通常用于二硫键的还原，可以作为生物学实验中的抗氧化剂。 它被广泛使用的原因是它的羟基使它能够溶解于水中，并且降低它的挥发性。由于具有较 低的蒸汽压，它的难闻的情况比起恶臭的硫醇要好得多。 2-巯基乙醇可以打开蛋白质中存在的二硫键：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH2cysSH+ HOCH2CH2S-SCH2CH2OH，二硫键被打开后可以使蛋白质的四级或三级结构被破坏。由 于 2-巯基乙醇能够打开蛋白质的结构，

4、它常常被用于蛋白质分析。而 2-巯基乙醇也常常被 用于保护蛋白质中自由的半胱氨酸巯基之间不会错误形成二硫键。作为还原剂，2-巯基乙 醇常常可以与二硫苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使用。 2-巯基乙醇是少数几种被发现可以延长小鼠寿命的化合物。在微克量级水平上，2-巯 基乙醇被观察到对实验鼠的生命具有多种可能的正面效应。3.TCEP 化学名称：三(2-羧乙基)膦；英文名称：Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP） ；分子 量：250.19。无色透明液体，不溶于脂肪烃，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、 二甲苯等，能与氯仿及四氯化碳混

5、溶，与醋酸纤维素、硝酸纤维素、醋酸丁酸纤维素、乙 基纤维素、聚氯乙烯、酚醛树脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。 TCEP 是一种非常有效的硫醇类还原剂，广泛用作蛋白质化学及蛋白质组学研究中二 硫键的定量还原剂。该试剂在水溶液中的稳定性和溶解性都很好。在酸性、碱性溶液中的 稳定性也不错。与其他类别的硫醇类还原剂如 DTT 相比，TCEP 不仅是一种高效的二硫键还原剂，而且在某些巯基的交联反应中不需要除掉。因而在蛋白质化学及蛋白质组学研究 常常优先选择 TCEP。 TCEP 在很宽的 PH 值范围内都可以选择性定量地还原哪怕水溶性很差的烷基类二硫化 合物。通常室温下反应不到 5 分钟就可以完成。TC

6、EP 没有难闻的气味，而且在空气中不 怕氧化。 补充： DTT，beta-巯基乙醇，TCEP 等是巯基类还原剂。还原剂可以保护蛋白质上自 由的巯基不被氧化，从而避免蛋白质的聚集或变性。在结晶实验中，一般使用的还原剂工 作浓度是 110 mM。 beta-巯基乙醇是上述三种还原剂中还原能力最差的一个，因为它本身只有一个巯基。 它的效果一般只能维持 23 天。因此，在实验中要每隔 23 天补加一次 beta-巯基乙醇来 维持它的作用。由于 beta-巯基乙醇是挥发性的，因此，可以在池液中加入 beta-巯基乙醇， 利用它的挥发扩散到液滴中去。 二硫苏糖醇 DTT 有两个巯基基团，其作用能维持 37

7、 天。DTT 的挥发性不像 beta-巯 基乙醇那么强，所以使用时应该直接加入到悬滴中去。DTT 还可以通过微透析的方法加入。TCEP 的还原能力比 beta-巯基乙醇和 DTT 都强，它的作用可以维持 23 周。TCEP 能使结晶用的缓冲液酸化。与 DTT 类似，TCEP 需要直接加入到悬滴中，因此可以考虑微 透析法。 beta-巯基乙醇，DTT，和 TECP 的作用机制可能不同。像其他添加剂一样，如果你发 现一类物质对样品的稳定性和结晶有利，则可以去筛选这一类物质中最适合你的样品的一 种。我们建议是，最好这三种还原剂都尝试一下，去发现最适合的。 还原剂可以与金属离子结合，金属离子其被还原，

8、而还原剂的作用被抑制。这就使得 用重金属原子作同晶置换法遇到了麻烦。可以使用 EDTA 来避免还原剂被金属离子抑制。 但是，如果金属离子是你的样品蛋白维持活性所必须的，就要小心使用 EDTA 了。 碱性条件下，beta-巯基乙醇和 TECP 更稳定，效果要好于 DTT。酸性条件下，TCEP 的稳定性也要好过 DTT。 DTT 可以使 Ni 被还原，因此在用 Ni 柱纯化 His 标签的蛋白时要避免使用 DTT，而应 该考虑 beta-巯基乙醇和 TECP。 半胱氨酸也是一种还原剂。在结晶实验中，半胱氨酸局限性很明显，那是由于它容易 形成六角形的晶体。但是，半胱氨酸是一种有效的添加剂，能带来明显

9、的效果，不过需要 铭记它的局限性。 如果预期到蛋白会被氧化，从制备样品开始就要加入还原剂，并且在整个流程中要不 断补加保证其效果。在悬滴法中，可以在池液里加入还原剂，利用还原剂的挥发扩散，保 证悬滴中还原性的环境。 在确定还原剂和样品比例时，需要考虑样品上自由巯基的数目和样品浓度。自由巯基 数目越多，样品浓度越高，还原剂的用量就越大。 含砷化合物与还原剂不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸钠是结晶中常使用的含砷化合物， 它们不能与还原剂共同使用。其他不能与还原剂一起使用的物质还包括：硝酸铵，过氧化 氢，高氯酸钾，硝酸钠。在使用某种物质之前，应该先查阅 Material Safety Data She

10、et (MSDS) 。4.SDSSDS 是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价 键。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与 SDS 充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物，复 合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间 原有的电荷差异，蛋白质-SDS 复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。SDS-PAGE 不仅可 以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 DTT 和巯基乙醇相比，作用相似，但 DTT 的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基

11、乙 醇低很多。而且 DTT 比巯基乙醇的浓度低 7 倍时，两者效果相近。但 DTT 价格略高一些。 DTT 有两个巯基集团，巯基乙醇只有一个巯基集团。常用蛋白变性剂常用蛋白变性剂盐酸胍和尿素尿素和盐酸胍在高浓度(48 mol/L)水溶液时能断裂氢键，从而使蛋白质发生不同程度 的变性。同事，还可以通过增大疏水基酸性残基在水相中的溶解度，降低疏水相互作用。 在室温下 46 mol/L 尿素和 34 mol/L 盐酸胍，可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态 的中点，通常增加变性剂浓度可提高变性程度，通常 8 mol/L 尿素的变性能力强。一些球 状蛋白质，甚至在 8 mol/L 尿素溶液中也不能完

12、全变性，然而在 8 mol/L 盐酸胍溶液中，他 们一般以无规则卷曲(完全变性)构象状态存在。 尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制：1、变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合， 形成变性蛋白质-变性剂复合物，当复合物被除去，从而引起 ND 反应平衡向右移动。随 着变性剂浓度的着呢国家，天然状态的蛋白质不断转变为复合物，最终导致蛋白质完全变 性。然而，由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的。因此，只有高浓度的变性剂才能引 起蛋白质完全变性；2、尿素与盐酸胍对谁说氨基酸残基的增溶作用。因为尿素和盐酸胍都 具有形成氢键的能力，当他们在高浓度时，可以破坏水的氢键结构，结果尿素和盐酸胍就 成为非极性残基的较好溶剂，使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加。尿素和 盐酸胍引起的变性通常是可逆的。但是，在某些情况下，由于一部分尿素可以转变为氰酸 盐和氨，而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应，引起蛋白质电荷分布的改变。因此，尿素引 起的蛋白质变性有时很难完全复性。一些还原剂(半胱氨酸、抗坏血酸、-巯基乙醇和 DTT)的使用，可以还原二硫键，能有助于变性后蛋白的复性。