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1、流式细胞仪检测细胞周期操作步骤取对数生长期的 A549 细胞，按 1106 cells/ mL 以 1mL 接种于100mm 培养皿内24h 后，进行所需的处理（比如加药,照射）特定时间后终止培养，进行下一步的实验收集原培养液，洗后的 PBS 和消化后的细胞，将三者混匀放入15ml离心管中1000rpm 离心 5min（短时低速离心）弃上清，用 1.5ml 预冷 PBS，1000rpm 离心 5min 后去除 PBS 和细胞悬液内的细胞碎片加入 1.5ml 预冷 PBS,在涡旋状态下加入 3.5ml 无水乙醇，混匀后，于 4固定 30min,或-20长期保存。1000r/min,离心 5min
2、将乙醇吸除，加 PBS 清洗混匀1000r/min,5min 再离心一遍，将残留在细胞上的乙醇除去吸除离心管内 PBS，加入 200ul PBS 和 2ul 的 RNA 酶（0.25mg/ml）(37下孵育 30min)加入 0.5ml 的 50ug/ml 的 PI 溶液室温下避光染色 30min将离心管内的细胞过滤(300um 尼龙网膜)至含有 PBS 的 EP 管中（PI 具有很强的粘附性，容易使细胞聚团） ，标记 EP 管提前一天网上预约开机（先开仪器后开软件）流式细胞仪的结构一般分为 5 部分：流动室及液流驱动系统； 激光光源及光束成形系统； 光学系统； 信号检测、存贮、显示、分析系统
3、； 细胞分选系统。检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞，然后插入流式细胞仪上流动室内充满鞘液，细胞排成单列由喷嘴中心喷出，形成细胞液柱液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光（488nm 激发光源）荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析（荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合，可以检测出细胞周期各时相细胞比例）在用第三方软件分析之前，将流式结果按如下所示导出结果分析Modfit 软件分析图片拷贝：直接 Ctrl+CFlowjo 软件分析FCM-DNA 量分析 1 个细胞增殖群时，可将 DNA 含量分布组方图分为三部分，即 G0/1、S、G2M。G0/1 和 G2M 细胞峰的 DNA分
4、布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布检测结果刻录光盘保存关机（先关软件后关仪器，关机前需清洗）正常细胞 DNA 含量：2n-4n凋亡细胞：核内 DNA 断裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丢失，胞内 DNA 含量减少。PI 染色后，荧光强度减小而形成一个 DNA 含量小于 2n 的分布区（亚 G1 峰） 。1、纵坐标 Cell Number：即计数的有效细胞数；2、横坐标 DNA Content：即 DNA 含量；3、G1、G2、S 三期在图中已经标示；4、右侧数字含义：Dip G1-53.84% at 55.56，即 G1 期 DNA 含量平均值为 55.56；53.
5、84%即 G1 期细胞数占总数的 53.84%；Dip G2-5.64% at 107.72，即 G2 期 DNA 含量平均值为 107.72，5.64%即G2 期细胞数占总数的 5.64%；Annexin V-EGFP/PI 双染法检测细胞凋亡基本原理：磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素（Annexin）发生特异结合；PI 是核酸荧光染料，不能透过正常细胞膜，只能进入已经破损的细胞膜，在嵌入双链 DNA 后释放红色荧光，荧光强度与 PI 结合量呈良好的线性关系。正常细胞：膜完整，PS 不外翻PI-/Annexin- 凋亡早期：膜完整，PS 翻转PI-/Annexin+凋亡晚期：PS 外翻，膜通透
6、性增加PI+/Annexin+ 坏死细胞：膜严重破损，PS 不外翻PI+/Annexin+ 几乎不存在膜结构PI+/Annexin-实验步骤：取对数生长期的细胞，按 1106 cells/ mL 以 1mL 接种于培养皿内24h 后，进行所需的处理（比如加入药物）特定时间后终止培养，进行下一步的实验细胞用 0.25%胰酶 37消化 5min(胰酶消化时间不易过长，以防引起假阳性）加入 PBS 制成细胞悬液（移液枪吹打 6-8 次）倒置显微镜下观察细胞状态（单个分离悬浮）将细胞悬液移入 15ml 离心管中 2000rpm 离心 5min,PBS 吸除用 PBS 清洗细胞 2 次（2000rpm，
7、离心 5min 收集细胞） 用 400ul 1Binding Buffer 悬浮细胞(浓度大约为 1106cells/ml)在细胞悬液中加入 5ul Annexin V-EGFP，轻轻混匀后于 2-8避光条件下孵育 15 min加入 10ul PI 后轻轻混匀,于 2-8避光条件下孵育 5 min在 1 h 内用流式细胞仪检测 流式细胞仪激发光波长采用Ex.= 488nm双波长激发，Em.= 510 nm 检测 EGFP 荧光(FL1 channel)和575 nm 的发射波长检测 PI。细胞应可分成三个亚群：活细胞仅有很低的荧光强度，凋亡细胞有较强的绿色荧光，坏死细胞（包括极晚期凋亡细胞）有绿色和红色荧光双重染色。在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞，为（Annexin V-/PI-） ；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为 Annexin V +/PI+；而右下象限为凋亡细胞，显现 Annexin V +/PI-。
