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1、琼脂糖凝胶电泳常见问题分析问题问题可能原因可能原因解决方法解决方法核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭 4C 保存DNA Marker 降解保存不当4C 或-20C 保存，避免多次反复冻融；不可加热琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶DNA Marker 无法正确分离电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸浓度过低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品条带黯淡DNA 条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有 DNA 结合蛋白或
2、高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳条带模糊或弥散染色时间过长或拍照前放置过久，DNA 条带弥散电泳结束后及时观察、拍照DNA 条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的 DNA 条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD 和 TBE 缓冲液适于分析较小分子量的DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的 DNA 片段电泳时间过长或电压过高，DNA 走出凝胶缩短电泳时间，调整电压条带缺失电极插反，DNA 走出凝胶正确连接电极方向核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备
3、样品条带大小不正确 DNA 酶切 Marker 的 cos 位点复电泳前 65C 加热 5 分钟，冰上冷却 5 分钟性以后再上样相同分子量的 DNA 片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率判断 DNA 分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含 AT 碱基的 DNA迁移率比同分子量富含 GC 碱基的 DNA 片段慢梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶不同样本的上样条件不同选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有 DNA 结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液
4、未完全浸没凝胶上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和 DNA 变性根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝胶中加入 EB 造成染色不均加入 EB 时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡带型异常点样孔质量差待凝胶完全凝聚后再取出梳子错误选择了低浓度凝胶,观察大片段用低浓度凝胶,观察小片段要用高浓度比如观察 100bp 的小片段用 2%凝胶跑电泳琼脂糖质量不好,质量不好的琼脂糖分离小片段容易扩散,即使是使用高浓度凝胶换用质量好的琼脂糖小片段扩散,条带模糊,粗选择了不合适的电泳缓冲液SD 和
5、TBE 缓冲液适于分析较小分子量的DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的 DNA 片段DNA 凝胶电泳简介凝胶电泳简介一、实验原理一、实验原理DNADNA 电泳是基因工程中最基本的技术，电泳是基因工程中最基本的技术，DNADNA 制备及浓度测定、目的制备及浓度测定、目的 DNADNA 片段的分离，重片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。根据分离的 DNADNA 大小及类型的不同，大小及类型的不同，DNADNA 电泳主要分电泳主要分两类：两类： 1 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳 适合分离适合分离 1kb1
6、kb 以下的片段，最高分辨率可达以下的片段，最高分辨率可达 1bp1bp，也用于，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称 PAGEPAGE 纯化。纯化。 2 2、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳 可分离的可分离的 DNADNA 片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.50.50.6%0.6%的凝胶可以分离的的凝胶可以分离的 DNADNA 片段范围为片段范围为 20bp20bp50kb50kb。电泳结果用溴化乙锭（。电泳结果用溴化乙锭（EBEB）染）染色后可直接在紫外下观察，并且可观
7、察的色后可直接在紫外下观察，并且可观察的 DNADNA 条带浓度为纳克级，而且整个过程一般条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1 1 小小时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。时即可完成。由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由琼脂糖是从琼脂中分离得到，由 1 1，3 3 连接的吡喃型连接的吡喃型 b-D-b-D-半乳糖和半乳糖和 1 1，4 4 连接的连接的 3 3，6 6脱水吡喃型阿脱水吡喃型阿 a-L-a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为半乳糖组成，形成相对分子量为 104104105105 的长链。琼
8、脂糖加热溶解后的长链。琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。表 1 1 给出了不同浓度凝胶对给出了不同浓度凝胶对 DNADNA 片片段的线性分离范围。段的线性分离范围。表表 1 1 不同类型琼脂糖分离不同类型琼脂糖分离 DNADNA 片段大小的范围片段大小的范围琼脂糖琼脂糖/ /标准标准高强度高强度低熔点低熔点低粘度低熔点低粘度低熔点0.30.30.50.5700b
9、p700bp25kb25kb0.80.8500bp500bp15kb15kb800bp800bp10kb10kb800bp800bp10kb10kb1.01.0250bp250bp12kb12kb 400bp400bp8kb8kb 400bp400bp8kb8kb1.21.2150bp150bp6kb6kb 300bp300bp7kb7kb300bp7kb300bp7kb1.51.580bp4kb80bp4kb200bp4kb200bp4kb200bp4kb200bp4kb2.02.0100bp3kb100bp3kb100bp3kb100bp3kb3.03.0500bp1kb500bp1kb5
10、00bp1kb500bp1kb4.04.0100bp500bp100bp500bp6.06.010bp10bp100bp100bp由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象胶的再溶化，象 NaClONaClO4 4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1 1）低熔点琼）低熔
11、点琼脂糖凝胶，用于脂糖凝胶，用于 DNADNA 片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（等；（2 2）高熔点凝胶，可分离小于）高熔点凝胶，可分离小于 1kb1kb 的的 DNADNA 片段，专用于片段，专用于 PCRPCR 产物的分析；（产物的分析；（3 3）快速）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4 4）适用于）适用于 DNADNA 大片段的分离。大片段的分离。（5 5）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类
12、型的，选择）其它类型。各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。原则是考虑合适的机械强度和熔点。三、三、DNADNA 电泳影响因素电泳影响因素DNADNA 为碱性物质，在电泳（缓冲液为碱性物质，在电泳（缓冲液 pH=8pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。而泳动。而 DNADNA 链上的负电荷伴随着链上的负电荷伴随着 DNADNA 分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNADNA 的分离类似分子筛效应。电泳中影响的分离类似分子筛效应。
13、电泳中影响 DNADNA 分子泳动的因素很多，主要分两方面：分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNADNA 分分子特性和电泳条件。子特性和电泳条件。 1 1、DNADNA 分子大小：分子大小：DNADNA 分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状率与线状 DNADNA 分子质量的对数值成反比。分子质量的对数值成反比。 2 2、DNADNA 分子构型：对于质粒分子构型：对于质粒 DNADNA 分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电
14、泳中质粒成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。常规电泳中质粒 DNADNA 分子的分子的 3 3 种构种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。 3 3、不同的胶浓度：对于同种、不同的胶浓度：对于同种 DNADNA 分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对分子胶浓度越高，电泳速率越慢。不同胶浓度对于于 DNADNA 片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子 DNADNA 片片段呈现较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段段呈现
15、较好的线性关系。所以常规实验中对于小片段 DNADNA 分子的分离采用高浓度的胶分离分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用（有时甚至用 2 2的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。 4 4、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为 5V/cm5V/cm，这样的场，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定强下虽能得到结果，但分辨率不高。在精确测定 DNADNA 分子大小时，应降低电压至分子大小时，应降低电压至 1V/cm1V/cm。电场强度偏高时电泳分离的线性范
16、围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致导致 DNADNA 片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压，如对于片段的降解。实验中要根据需要选择合适电压，如对于 DNADNA 大片段的分离可适当大片段的分离可适当选择较低电压进行（在选择较低电压进行（在 SouthernSouthern 杂交中的杂交中的 DNADNA 电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子子 DNADNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。时间。 5 5、溴化乙锭：简称、溴化乙锭：简称 EBEB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到 DNADNA 碱基对间，碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺
