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1、液体菌种的制作及使用方法液体菌种的制作及使用方法随着食用菌生产的发展,食用菌制种方法在传统固体制作的基础上在不断的改进和提高,其中液体菌种的制作便是其中之一。 一、液体菌种的培养方法常见的有采用摇床来生产的摇瓶培养法和采用发酵罐来生产的深层培养法。若少量生产，可以用摇瓶培养法。深层培养需要一整套工业发酵设备，如锅炉、空气压缩机、空气净化系统、发酵罐等，故投资大，只适用于工厂化的大规模生产。而摇瓶培养投资少，设备技术简单，适合一般菌种厂生产使用。本节主要介绍摇瓶培养的技术方法。1、食用菌液体发酵的培养基根据培养基中组成的不同，可分为天然培养基和合成培养基。天然培养基的组成均为天然有机物。合成培养
2、基则是采用些已知化学成分的营养物质作培养基。在生产上，还根据工艺将培养基分为孢子培养基、种子培养基及发酵培养基。但无论如何划分，每一种培养基的组成中都离不开碳、氮、无机盐、微量元素、维生素和生长素等。1.1、碳、氮比(C/N)碳、氮比指碳源及氮源在培养基中的含量比。构成菌丝细胞的碳、氮比通常是：812:1。由于菌丝生长过程中，一般需 50%的碳源作为能量供给菌丝呼吸，另 50%的碳源组成菌体细胞。因此培养基中理想碳、氮比的理论值为 1624:1。在液体培养中以菌丝增殖为目的的培养，通常碳、氮比以 20:1 为宜。虽然食用真菌的液体培养一般要求较高的碳与氮比，即 C:N20:1 左右周口职业技术
3、学院毕业论文1生长较好，但许多菌种也能在较宽的碳、氮比范围内生长。不同的菌种所要求合适的碳、氮比，可通过实验求得。1.2、无机盐与微量元素许多无机盐及微量元素对菌种的生理过程的影响与其浓度有关。不同的菌种，对无机盐及微量元素要求的最适浓度也不同。1.2.1磷 磷是细胞中核酸、核蛋白等重要物质的组成部分，又是许多辅酶(或辅基)高能磷酸键的组成部分。磷是食用菌液体发酵不可缺少的物质，常加入磷酸二氢钾以提供磷，加入量大约为 0.1%0.15%。1.2.2镁 镁在细胞中起着稳定核蛋白、细胞膜和核酸的作用，而且是些重要酶的活化剂，是食用真菌液体培养中不可缺少的营养成分。一般通过加入硫酸镁以提供镁，浓度通
4、常是 0.05%0.075%。1.2.3钾、钙、钠 钾不参与细胞结构物质的构成，但控制原生质的胶态和细脑膜的透性。钙离子与细胞透性有关。钠离子能维持细胞渗透压，钠离子可以部分代替钾离子的作用。三种物质需求量甚微，若采用天然培养基，可不必另加。1.2.4硫、铁 硫是菌体细胞蛋白质的组成部分(胱氨酸、半胱氨酸及蛋氨酸中皆含硫)，铁是细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的组成部分，亦是菌体有氧代谢中不可缺少的元素。1.2.5锌、锰、钴、铜 锌、锰、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂。铜是多元酚氧化酶的活性基。在配制培养基时应注意，镁和磷的添加不宜过多，否则会带来危害。菌体对锌、锰、钴、铜等微量元素的需求
5、量甚少，一般天然有机原料中均有，不必另加。碳酸钙本身不溶于水，但可以调节周口职业技术学院毕业论文2培养其中的酸碱度。磷酸盐与碳酸钙不宜混合灭菌，否则会形成不溶于水的磷酸盐，使可溶性的磷酸盐浓度大大降低。1.3、维生素 维生素在细胞中作为辅酶的成分，具有催化功能。大多数食用真菌的培养都与 B 族维生素有关，维生素 B1 是目前已知对绝大多数食用真菌生长有利的维生素。其适宜浓度在 501000g/L 之间。2、摇瓶振荡培养技术培养液配制好后，装入 500mL 容量的三角烧瓶中，每瓶装量为 100mL，并加入 015 粒小玻璃珠，加棉塞后再包扎牛皮纸封口，在 1.5kg/cm2 压力下灭菌 30 分
6、钟，取出冷却到 30以下时，接入一块约 2 平方厘米的斜面菌种，于 2325下静置培养 48 小时，再置往复式摇床上振荡培养，振荡频率为 80100 次/分，振幅 6cm10cm。如果用旋转式摇床，振荡频率为 200220 转分。摇床室温控制在 2425，培养时间因菌类不同而异，一般是在 7 天左右。培养结束的标准是：培养液清澈透明，液中悬浮着大量小菌丝球，并伴有各种菇类特有的香味。二、液体菌种的检验方法对液体菌种进行检验可采用感官检查和取样测验相结合的方法。2.1. 感官检查 可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液呈黄色或黄褐色，清澈透
7、明，菌丝颜色因菌种而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状或棒状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液周口职业技术学院毕业论文3体菌种，在瓶中所占比例可达 80%左右。四看 pH 值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经 35 天颜色改变，说明培养液 pH 值到达 4.0 左右，为发酵点；如果在 24 小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵
8、母线。旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5 分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。嗅：在旋转样品后，打开瓶盖嗅气味。培养好的优质液体菌种，均具有芳香气味；而染杂菌的培养液则散发出酸、甜、霉、臭等各种异味。2.2. 取样测验 可取液体菌种进行称重检查和粘度检查；生长力测定和出菇试验；化学检查，包括测 pH 值、糖含量和氧含量等；显微检查，包括细胞分裂状态观
9、察、普通染色和特殊染色等。三、液体菌种的使用方法三、液体菌种的使用方法液体菌种可作原种使用，也可作栽培使用。3.1. 作原种 取一支 100ml。兽用注射器，去掉针尖，换一根内径1mm2mm，长 100mm120mm 的不锈钢钢管，制成一个菌种接种器。使用前，洗净接种器并用纱布包好，经高压蒸汽灭菌，冷却后抽取液体菌种即可进行接种。经灭菌待接入菌种的原种瓶，先要在无菌条件下去掉棉塞，并改换无菌周口职业技术学院毕业论文4薄膜包扎瓶口。接种时，将针管插入瓶口上的薄膜，每瓶接种量为10mL15ml，要注意使液体菌种均匀分布在培养基表面，拔出针管后要立即用胶布贴封针孔，竖放在培养室的床架上进行培养。3.2. 作栽培种或直接进行栽培 液体菌种在作栽培使用时，瓶栽的每瓶接种量为 10mL15mL；熟料袋栽的每袋接种量为，小袋 10mL15mL，大袋的 20mL30mL；开放式床栽的，每平方米接种量为 500mL1000mL，不需要接种针筒，可直接均匀洒在培养料面，或进行穴播
