钩端螺旋体疫苗的安全性与免疫效果评价及其推广应用

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1、钩端螺旋体疫苗的安全性与免疫效果评价及其推广应用一、重要性钩端螺旋体病（Leptospirosis, 简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体 （Leptospira interrogans, 简称钩体）引起的一种分布广泛的人畜共患病，全世 界已从 200 多种动物分离出钩体，并能长期带菌。我国已从病人、家畜、家禽 及野生动物等 60 多种动物分离出钩体。啮齿目鼠类是钩体许多菌型的主要储存 宿主，其中三种鼠（黑线姬鼠、黄毛鼠、黄胸鼠）为主要传染源。家畜以猪和 犬为钩体病的主要传染源。患者感染该病的临床特点为高热、全身酸痛、乏力、球结膜充血、淋巴结 肿大和明显的胖肠肌疼痛，重者可并发肺出血、黄疽、脑膜脑

2、炎和肾功能衰竭 等。犬主要表现为出血性黄疸、高热、出血性素质、流产、皮肤坏死、水肿 等症状。世界五大洲均有此病，目前本病流行主要发生在亚洲、非洲、中美洲、南 美洲的一些国家。欧洲、大洋洲及北美洲一些国家每年仍有散发病例。洪水等 自然灾害会促发该病的爆发流行，是历史上一些大水之后“大疫”的主要疫病之 一。由于人们对其致病和免疫机制了解欠缺，至今无简便的诊断手段和广泛使 用的高效安全的疫苗。虽然目前的抗生素治疗有效，但该病依然是一种潜在的 危害严重的自然疫源性疾病。据 WHO 报道，全世界每年严重钩体病病例可达 数万例，死亡率为 5%-20%。我国是受钩体病危害十分严重的国家，钩体病给人们健康以及

3、农牧业生产 带来很大的损失，自 1955 年本病被列入法定报告传染病以来，全国累计报告 240 多万病例，死亡万多病例，全国 31 个省（市） 、自治区均有病例报告 （未包括台湾省） 。钩体病与洪涝灾害和降雨量多少有着密切关系，我国发生过 几十次大规模钩体病流行，年发病率高达 10/10 万以上有 10 次，其中 9 次发生 在洪涝灾害之年。进入 90 年代后钩体病流行呈下降趋势，但每年仍在不同地区 出现暴发疫点。江苏省地处长江中下游，全省多湖泊沟渠以及每年充沛的降雨量容易导致 钩体病的流行。我市钩体病疫情也较为严重，19902008 年间，我市累计发病 2005 例，死亡 82 例，病死率为

4、 4.09 ，年发病率在 0.1225.7810 万之间， 年均发病率为 3.0510 万。发病资料显示，某市每 34 年出现流行波峰，其 中 1991 年和 1994 年发生两次大流行，发病数分别为 402 例、292 例，发病率 高达 25.78/10 万、18.73/10 万。虽然钩体病一直威胁着人类和伴侣动物的健康，影响畜牧业生产，是一种 常见的人畜共患病，但是由于人们的认识以及先进科技手段的缺乏，目前一直 没有有效的实验室诊断方法对钩体病进行确定性诊断，同时缺少钩体病近年的 流行病学资料。安全、有效的疫苗被认为是防治钩体病最有效的方法，但是由 于钩体疫苗种类、数量以及生产疫苗厂商众多

5、，目前还未曾对各种钩体疫苗的 免疫保护效果进行综合评价比较，由于缺少这方面的工作，因此一直未能对该 病进行统一免疫接种，保护人畜和伴侣动物的健康。考虑到钩体病对我市市民和伴侣动物可能造成的危害，我们拟建立具有高 特异性、高敏感性、高重复性、操作简便、自动化程度高的实时荧光定量 PCR 技术，用于对钩体病的诊断、流行病学调查以及疫苗免疫效果的评估。同时在 多个厂商的多种钩体病疫苗中适当挑选出几种疫苗进行免疫效果的评估，选择 既有效又易于推广应用的疫苗进行小规模的临床试验，最终选择出一种安全有 效易于在我市普及推广应用的疫苗，促进该病的免疫防疫，保障人畜以及伴侣 动物的健康。二、国内研究现状和发展

6、趋势目前钩体病的实验室诊断方法大致可以归纳为 4 个方面：分离培养、暗视 野显微镜直接镜检、血清学诊断和分子生物学诊断。在早期诊断方面，分子生 物学诊断有着十分显著的优势，特别是其中的 PCR 有着很大的应用前景。PCR 可以用来检测血液、尿液、脑脊液、精液以及组织样本中的钩体 DNA。有研究表明，尿液 PCR 检测用于早期诊断更敏感，针对 16SrRNA 基因 序列的 PCR 检测被认为是一种较好的诊断钩体病的方法，但 16SrRNA 的多态 性较差，因此发展了针对其他靶基因片段的 PCR 检测如：编码 OmpL1 ,DNA 解旋酶，RpoB, Lig, LipL32/Hap1 的基因和转录

7、调节因子以及 DNA 重复元件。 这些方法都能够敏感特异地诊断钩体病并对所感染的钩体类型进行初步的鉴定。值得注意的是，最近发展起来的实时定量 PCR(real-time PCR)用于钩体病的 诊断取得了很好的效果。与常规 PCR 相比，real-time PCR 有明显的优势，该方 法具有特异性强、操作简便、自动化程度高、快速高效、同时能对起始模板进 行准确定量的特点。用该方法可成功从钩体病患者和患犬的血清和尿液样本中 检测到钩体，证实该方法具有很好的敏感性。Merien 等用 real-time PCR 检测了 12 份临床样本，从样本处理到数据分析一共只用了 3 小时，该方法的灵敏度达 到

8、了 50 个钩体/mL。Smythe 和 Slack 等也证明了该方法应用于钩体病诊断有着 高特异性和敏感性。目前国内尚未建立实时定量 PCR(real-time PCR)诊断钩体病的方法，我们拟 通过 1 年时间建立钩体病 real-time PCR 诊断方法，并应用该方法对钩体病进行 流行病学调查以及辅助进行钩体疫苗免疫效果的评价。安全、有效的疫苗是防治钩体病的最好方法。钩体疫苗的研究经历了菌体 疫苗、外膜疫苗、基因工程疫苗等阶段。菌体疫苗是将钩体进行灭活处理，制成灭活的钩体疫苗，钩体外膜的脂多 糖是钩体灭活疫苗的主要成分，具有较强的免疫原性和保护性。但菌体疫苗的 免疫次数多，剂量大，存在

9、不良反应，因此接种率较低，免疫水平也不高，且 仅对部分钩体有交叉保护。也不能阻止患病动物肾脏带菌和尿液排菌。外膜疫苗是利用钩体的外膜在钩体粘附、免疫和致病中起着十分重要的作 用，将钩体的外膜作为药物治疗的靶点而制成的疫苗。钩体外膜有较强的免疫 原性，可以产生高效价的抗体，显示出极强的完全性免疫保护作用，钩体的种、 属、群、型抗原均存在于外膜中。外膜疫苗免疫动物后不仅有较高的保护效果，还能阻止动物肾脏带菌，同时刺激机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。基因工程疫苗是利用基因工程技术制成的核酸疫苗或重组蛋白质疫苗。核 酸疫苗既能刺激体液免疫、又能刺激细胞免疫，而且具有结构简单、生产成本 低、稳定性高等

10、优点，是钩体疫苗研制的一个方向。重组蛋白质疫苗是利用致 病性钩体蛋白质特别是表面蛋白质，最有可能与宿主的免疫系统接触而产生抗 体，故通过筛选鉴定哪些致病性钩体表面的保守蛋白质，能对不同血清型钩体 产生交叉免疫保护，应用单个或者几个钩体蛋白质作为疫苗，就有可能对不同 血清型的钩体感染产生免疫防御作用。目前市场上有多种钩体疫苗，包括二价、多价苗以及多联疫苗。通过设计 动物免疫保护试验，制定合理的免疫程序，选择最有效易于推广应用的疫苗进 行小规模临床试验，使该疫苗在我市得到推广应用，并进一步降低钩体病的发 病率和死亡率，保障广大市民和伴侣动物的身体健康，保护人们的生命财产安 全。三、主要研究内容和技

11、术关键1、 建立实时定量 PCR 诊断方法；设计实时荧光定量 PCR 的 Taqman 探针和引物，摸索反应条件，制作标准 曲线。2、 不同种类疫苗的效果评估；不同种类疫苗其免疫效果差别较大，挑选出不同种类疫苗，在相同的免疫 剂量和免疫程序下，比较免疫抗体效价和免疫保护情况，筛选出能产生较好免 疫效果、显著降低钩体病的发病率和死亡率的疫苗。3、 疫苗最佳使用剂量的研究；疫苗使用剂量与疫苗使用以及能否刺激产生有效保护密切相关，疫苗使用 剂量过小不能刺激产生有效保护；而如果过量则造成浪费和成本的增加，并且 可能导致免疫耐受，反而降低了免疫效果。通过对多个剂量进行试验，找到能 刺激产生良好的免疫保护

12、效果的最佳使用剂量。4、 疫苗免疫程序的制定；只有应用合理的免疫程序才能保证疫苗产生最佳的免疫效果，使抗体水平 一直保持在较高水平，保护机体抵抗钩体病菌的侵入。5、 血清学效果评价；抗体检浏方法按经典的显微镜凝集试验方法执行。血清稀释倍数从 1:10 开 始，直至终点效价以上 2 个滴度。比较各疫苗刺激产生的血清抗体的阳转率以 及抗体水平的高低，从而判断疫苗免疫效果的好坏。6、 流行病学效果评价；利用建立的实时定量 PCR 还可以对我市范围内的畜禽养殖场以及伴侣动物 进行一次较为全面的流行病学调查，填补我市钩体病流行病学数据的缺乏，为防治钩体病提供数据支持和理论指导，以制定有效的钩体病防治措施

13、，不断我 市减低钩体病的发病率。7、 小规模钩体苗接种的反应性对筛选出来的钩体苗进行小规模应用，进一步检查其有效性，为在我市范 围内大规模推广应用打下基础。四、主要创新点及知识产权情况1、钩体病实时定量 PCR 诊断方法的建立；2、挑选出有效且易于在我市推广的钩体苗；3、运用实时定量 PCR 对钩体病进行流行病学调查；4、以伴侣动物为对象对该病进行效果评价国内尚属首次；6、保护伴侣动物免受钩体病的感染，保障广大市民身体健康。五、现有工作基础和条件六、项目计划总投资及经费来源，支出安排及明细七、项目预期目标1、 钩体病实时定量 PCR 诊断方法的建立；2、 完成钩端螺旋体疫苗的安全性与免疫效果评价；3、 完成钩端螺旋体疫苗的前期小规模钩体苗接种试验；4、 降低钩端螺旋体病在畜禽以及伴侣动物中的发病率和死亡率，从而保障广 大市民的身体健康。