《肝脂酶基因多态性与脑梗死的相关性研究（毕业设计-神经病学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肝脂酶基因多态性与脑梗死的相关性研究（毕业设计-神经病学专业）（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、上 海 交 通 大 学硕 士 学 位 论 文肝 脂 酶 基 因 多 态 性 与 脑 梗 死 的 相 关 性 研 究姓 名 ： 王 云 玲申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 神 经 病 学指 导 教 师 ： 陈 生 弟20080406肝脂酶基因多态性与脑梗死的相关性研究摘 要目的 探讨上海汉族人群肝脂酶（ hepatic lipase， HL）基因启动子710T/C、 763A/G 多态性与血浆脂蛋白、动脉粥样硬化性脑梗死的关系。方法 采 用 聚 合 酶 链 反 应 -限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 （ PCR-RFLP）技术 检 测 147 例 动 脉 粥 样 硬 化 性 脑
2、 梗 死 （ atherosclerotic cerebral infarction，ACI） 患 者 和 118 例 无 心 脑 血 管 疾 病 的 老 年 人 肝 脂 酶 基 因 启 动 子 710T/C、763A/G 基 因 型 ， 研 究 其 对 血 脂 代 谢 和 动 脉 粥 样 硬 化 性 脑 梗 死 的 影 响 。结果 脑梗死组的基因型和等位基因频率分布与对照组相比，无明显 差 异 ； 脑 梗 死 组 中 ， 肝 脂 酶 基 因 启 动 子 710T/C、 763A/G 突 变 型 （ CC和 TC、 GG 和 AG） 的 甘 油 三 酯 （ TG） 水 平 高 于 无 突 变
3、型 （ TT、 AA） ，而 纯 突 变 型 （ CC、 GG） 的 高 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 （ HDL-C） 水 平 、 高 密度 脂 蛋 白 胆 固 醇 与 总 胆 固 醇 的 比 值 （ HDL-C/TC） 均 低 于 无 突 变 型 （ TT、GG） ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ P0.05） 。上 述 实 验 对 象 均 为 我 国 上 海 汉 族 人 ， 彼 此 之 间 无 血 缘 关 系 ， 均 除 外 冠 心 病 、 周围 血 管 疾 病 、 甲 状 腺 疾 病 、 结 核 、 恶 性 肿 瘤 、 严 重 肝 肾 功 能 不 全 等 疾 病 。 所 有 入
4、 选对 象 至 少 1 个 月 内 未 使 用 过 降 脂 药 物 。2.1.2 主 要 仪 器 与 试 剂台 式 高 速 离 心 机 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂台 式 高 速 冷 冻 离 心 机 上 海 力 申 科 学 仪 器 有 限 公 司PCR 扩 增 仪 杭 州 博 日 公 司电 热 恒 温 水 槽 上 海 医 疗 器 械 七 厂11微 量 进 样 器 上 海 高 欣 玻 璃 仪 器 厂移 液 器 上 海 大 龙 医 疗 设 备 有 限 公 司垂 直 电 泳 槽 上 海 天 能 科 技 公 司电 泳 仪 上 海 天 能 科 技 公 司凝 胶 成 像 系 统 上 海 天 能 科
5、技 公 司UNIQ-10 柱 式 临 床 样 品 基 因 组 抽 提 试 剂 盒 上 海 生 工 公 司Taq DNA 聚 合 酶 Promega 公 司扩 增 引 物 上 海 生 工 公 司 合 成Ava II、 Sph I 限 制 性 内 切 酶 上 海 生 工 公 司EDTA 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司TEMED 国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司丙 烯 酰 胺 上 海 博 光 生 物 科 技 有 限 公 司硝 酸 银 上 海 化 学 试 剂 有 限 公 司氢 氧 化 钠 上 海 化 学 试 剂 有 限 公 司甲 醛 上 海 试 剂 厂 （ 昆 山 分 厂
6、 ）Tip（ 各 种 型 号 ） 浙 江 拱 东 医 用 塑 料 厂2.2 方法2.2.1 标 本 采 集 ： 所 有 被 检 者 均 禁 食 12 14 h， 采 空 腹 静 脉 血 5 ml，在 1 h 内 进行 离 心 分 离 ， 3000 转 /分 离 心 10min，血清用作各生化指标的测定，血球用作 DNA的 提 取 。2.2.2 各 项 生 化 指 标 的 测 定 ： 用 血 清 进 行 甘 油 三 酯 （ TG） 、 总 胆 固 醇 （ TC） 、高密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 （ HDL-C） 、 低 密 度 脂 蛋 白 胆 固 醇 （LDL-C） 和 血 糖 （ seru
7、m glucose,SG） 测 定 。2.2.3 基 因 组 DNA 的 提 取 ： 严 格 按 UNIQ-10 柱 式 临 床 样 品 基 因 组 抽 提 试 剂 盒 说12明 书 提 取 基 因 组 DNA。 具 体 基 因 组 DNA 抽 提 步 骤 ：（ 1） 取 200 l 抗 凝 血 球 ， 用 1ml 无 菌 水 8000 转 /分 离 心 2min， 去 上 清 ， 重 复 3次 。（ 2） 在 样 品 中 加 入 200ulTE 混 匀 ， 再 加 入 400ul DCL Buffer 混 匀 ， 再 加 入 3ulProteinase K， 55 保 温 20 min。（
8、3） 在 样 品 中 加 入 260ul 无 水 乙 醇 混 匀 ， 然 后 用 1mlTip 头 将 样 品 全 部 转 移 到UNIQ-10 柱 ， 柱 子 放 入 2.0ml collection Tube， 用 台 式 离 心 机 10000 转 /分 离 心 1 min。（ 4） 取 下 UNIQ-10 柱 ， 弃 去 collection Tube 中 的 废 液 ， 将 柱 子 放 回 同 一 根collection Tube， 加 入 500ul wash solution， 10000 转 /分 ， 室 温 离 心 1 min。（ 5） 重 复 第 4 步 骤 1 次 。（
9、6） 取 下 UNIQ-10 柱 ， 弃 去 collection Tube 中 的 废 液 ， 将 柱 子 放 回 同 一 根collection Tube， 10000 转 /分 ， 室 温 离 心 1 min， 以 除 去 残 留 的 wash solution。（ 7） 将 柱 子 放 入 新 的 无 菌 的 1.5ml 离 心 管 中 ， 在 柱 子 中 央 加 入 40ul ElutionBuffer， 室 温 放 置 2min 后 ， 10000 转 /分 离 心 1min， 离 心 管 内 的 液 体 即 为 基 因 组 DNA。（ 8） DNA 含 量 测 定 。（ 9） 母
10、 液 放 置 20 冰 箱 备 用 ， 取 10 ul 母 液 稀 释 2 倍 ， 作 为 工 作 液 放 置 4 冰箱 ， 平 时 实 验 研 究 用 。2.2.4 引 物 序 列 ： 根 据 基 因 库 序 列 号 M35425 设 计 一 对 扩 增 肝 脂 酶 启 动 子 710 的引 物 ， 序 列 号 如 下 ： 上 游 引 物 ： 5-TGTCTACTGTCCGTTATCCA-3； 下 游 引 物 ：5-GAAGCAAAGATGCCCTTGCC-3， 扩 增 引 物 由 上 海 生 工 公 司 合 成 。 因 为 肝 脂 酶启 动 子 763 与 肝 脂 酶 启 动 子 710
11、位 置 接 近 ， 所 以 扩 增 肝 脂 酶 启 动 子 763 的引物同扩增 肝 脂 酶 启 动 子 710 的 引 物 ， 序 列 号 如 上 述 。2.2.5 PCR 扩 增 ： PCR 反 应 总 体 积 为 25 l， 其 中 包 含 1PCR 缓 冲 液 、 Mg2+ 1.5mmol/L、 200mol/L dNTP 、 上 下 游 引 物 各 200 nmol/L、 DNA 200 ng、 Taq DNA 聚合 酶 1 U。 扩 增 循 环 参 数 ： 95 预 变 性 5 min， 然 后 按 变 性 95 40 s、 退 火 55 40s、 延 伸 72 90 s 共 35
12、 次 循 环 ， 最 后 72 延 长 至 5min。2.2.6 限 制 性 酶 切 PCR 扩 增 产 物 ： PCR 产物 5 l 分 别 用 10 U Ava II、 Sph I 限 制135性 内 切 酶 在 恒 温 箱 中 37 水 浴 4 h。 （ 肝 脂 酶 基 因 启 动 子 710 位 碱 基 用 Ava II 酶 进 行酶 切 ； 肝 脂 酶 基 因 启 动 子 763 位 碱 基 用 Sph I 酶 进 行 酶 切 。 总 反 应 体 系 为 10l， 其 中包 括 0.5l 限 制 性 内 切 酶 、 1l 相 应 Buffer、 0.5l 溴 酚 兰 、 3l 蒸 馏
13、 水 、 lPCR 产物。 ）2.2.7 酶 切 产 物 的 检 测 ：（ 1） 配 胶 ： 8 非 变 性 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 ： 30%Acr-Bis 4ml、 H2O 6.26ml、 5TBE3ml、 甘 油 1.5ml， 最 后 加 入 10%AP 100ul、 TEMED 20ul， 混 匀 。（ 2） 灌 胶 ： 加 入 预 先 准 备 好 的 两 块 玻 璃 板 之 间 ， 注 意 不 要 留 有 气 泡 ， 加 满 后 ，放 入 垂 直 齿 梳 ， 静 止 待 其 凝 固 。（ 3） 胶 凝 固 后 ， 拔 出 齿 梳 ， 用 自 来 水 冲 洗 未 结 合 的 Acr
14、、 Bis 后 ， 放 入 垂 直 电 泳槽 中 ， 加 入 1TBE 电 泳 缓 冲 液 。（ 4） 用 微 量 进 样 器 吸 取 5 l 酶 切 产 物 ， 小 心 加 入 各 齿 梳 间 ， 加 好 样 本 后 ， 接 通电 源 ， 条 件 为 100 V 电 泳 1.5 小 时 。（ 5）固定：取出电泳后凝胶，按加样顺序作好标记，用 10%乙 醇 -0.5%冰醋酸液 体 固 定 DNA10 min。（ 6） 染 色 ： 倒 掉 10%乙 醇 -0.5%冰 醋 酸 液 体 ， 蒸 馏 水 清 洗 两 遍 ， 用 0.1% AgNO3液 体 染 色 5 min。（ 7） 显 色 ： 倒
15、掉 0.1% AgNO3 液 体 ， 蒸 馏 水 清 洗 两 遍 ， 再 1.5%NaOH-0.4%甲 醛显 色 ， 直 至 DNA 条 带 显 色 为 止 ， 观 察 结 果 。2.2.8 PCR 产 物 核 苷 酸 序 列 测 定 ： 随 机 选 取 野 生 型 、 杂 合 子 、 突 变 纯 合 子 PCR 产物 各 二 例 ， 由 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 进 行 序 列 分 析 。2.2.9 统 计 学 处 理 ： 等 位 基 因 频 率 （ 纯 合 子 例 数 2 杂 合 子 例 数 ） 1/21/n。全 部 统 计 数 据 均 用 SPSS13.0 统 计
16、软 件 进 行 统 计 。 基 因 型 和 等 位 基 因 频 率 分 布 用 计 数资 料 表 示 ， 组 间 比 较 采 用 卡 方 检 验 ； 计 量 资 料 的 组 间 比 较 采 用 独 立 样 本 t 检 验 ； 计数 资 料 的 组 间 比 较 采 用 2 检 验 ； 肝 脂 酶 基 因 启 动 子 710T/C、 763A/G 多 态 与 血 脂 各项 指 标 的 关 系 采 用 单 因 素 方 差 检 验 ； 脑 梗 死 的 危 险 因 素 分 析 采 用 多 元 逐 步 Logistic回 归 。 每 组 等 位 基 因 均 确 认 符 合 Hardy-Weinberg 定 律 。14三、结果3.1 肝脂酶基因启动子 710T
