《植物双元质粒载体的构建2010.9.12》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物双元质粒载体的构建2010.9.12（33页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、植物双元质粒载体的构建,博士研究生：邓 磊指导老师：胡宗利 副教授 陈国平 教 授,一、背景知识,什么叫双元质粒载体,T - DNA 区( Transfer - DNA region) : 不同来源的菌株, T - DNA 的长度在1224kb ,它是在农杆菌侵染细胞时,从Ti 质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA ,其携带的基因与肿瘤的形成有关,但与T - DNA 本身的转移与整合无关。,LB 和RB ： 分布在T - DNA 区两端的边界各为25bp 的重复序列。其中14bp 是完全保守的, 分10bp (CAGGAATATAT) 和4bp ( GTAA) 不连续的2组。 LB 和
2、RB是T - DNA 转移所必需的,只要其存在, T - DNA 可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，T - DNA 的右边界在T - DNA 的整合中对于靶DNA 位点的识别具有重要作用,因此,尤以右边界更为重要。,一、背景知识,什么叫双元质粒载体,一、背景知识,什么叫双元质粒载体,一、背景知识,什么叫双元质粒载体,毒性区(Virulence region ,vir 区) : 位于T -DNA 以外的1 个3040kb 的区域内,该区段编的基因虽然并不整合进植物基因组中,但对T-DNA 的转移和整合非常重要。这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。目前,对章鱼碱型农杆菌Ti
3、质粒pTil5955 和胭脂碱型农杆菌Ti 质粒pTiC58的vir 区进行了全序列分析,在章鱼碱型Ti 质粒的vi r 区发现了8 个操纵子,分别为virA - virH ,共包括23 个基因( virA , virB1 virB11 , virC1 , virC2 ,vi rD1 virD4 , virE1 , virE2 , virF , virG , virH) 。而胭脂碱型Ti 质粒的vir 区不含virF 和virH 操纵子,它含有另一个基因tzs 。,一、背景知识,什么叫双元质粒载体,卸甲Ti质粒,微型Ti质粒,一、背景知识,双元表达质粒载体的结构,一、背景知识,质粒载体的类型与
4、抗性,克隆载体 克隆基因&测序 引入酶切位点 中间载体，以引入必要元件,一、背景知识,质粒载体的类型与抗性,表达载体 完整的T-DNA区 在植物中表达必要元件 筛选标记,一、背景知识,质粒载体的类型与抗性,载体的抗性,为什么一般中间载体是Amp抗性，而表达载体是Kan抗性？,二、载体构建的步骤,1. 基因的克隆,超表达 OR 沉默保真 OR 非保真全长 OR 片段测序,二、载体构建的步骤,2. 片段的选择,超表达,CDS,5-UTR,3-UTR,二、载体构建的步骤,2. 片段的选择,沉默,同源比对沉默片段初选(500-800bp)沉默片段的重新比对敲定沉默片段,二、载体构建的步骤,2. 片段的
5、选择,二、载体构建的步骤,2. 片段的选择,二、载体构建的步骤,2. 片段的选择,二、载体构建的步骤,3. 酶切位点的分析,二、载体构建的步骤,3. 酶切位点的分析,二、载体构建的步骤,4. 载体的选择,Xba I 同尾酶,二、载体构建的步骤,5. 载体构建思路的确定,二、载体构建的步骤,6. 酶切位点的选择和引入,利用载体引入酶切位点,二、载体构建的步骤,6. 酶切位点的选择和引入,利用PCR引入酶切位点,保护碱基酶切位点（方向&顺序）酶切位点的兼并,二、载体构建的步骤,7. 酶切体系的确定,单酶切&去磷酸化,去磷酸化的作用去磷酸化的对象去磷酸化的方法,双酶切,二、载体构建的步骤,7. 酶切
6、体系的确定,分步酶切,公用Buffer酶活性不高,二、载体构建的步骤,7. 酶切体系的确定,分步酶切,两酶切位点靠的太近,二、载体构建的步骤,7. 酶切体系的确定,酶切注意事项,异丙醇甘油离子浓度的浓缩酶的取用和保存星号效应,二、载体构建的步骤,8. 纯化,试剂盒纯化 条带单一； PCR产物做连接一般不用纯化； PCR产物酶切前需要纯化； PCR产物和质粒酶切后如果要做连接需要纯化。切胶回收 条带不单一； 和原载体骨架分开； 较大片段一般不用切胶回收酚氯仿抽提,二、载体构建的步骤,9. 转化与验证,连接体系 摩尔比； 较大体系可获得更高的连接效率。验证 菌落PCR验证请不要使用插入片段上引物； 提取质粒前请保存菌种； 提取质粒后先电泳验证再做PCR和酶切验证； PCR验证可选插入片段上引物。测序 没必要每步都测序，一般用构建好的中间载体测序。,三、载体构建的一些技巧,1. 酶切位点的引入,五、载体构建的一些技巧,2. 酶切位点的消除,五、载体构建的一些技巧,3.同尾酶的妙用,同尾酶 BamH I & Bgl II Xho I & Sal I Xba I & Spe I同尾酶的作用 消除酶切位点； 利用同尾酶可以避免载体和判断被破坏。,五、载体构建的一些技巧,3. 同尾酶的妙用,Thank You !,
