核酸提取及琼脂糖电泳

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1、核酸提取及琼脂糖电泳核酸是遗传信息的载体，是最重要核酸是遗传信息的载体，是最重要 的生物信息分子，是分子生物学研的生物信息分子，是分子生物学研 究的主要对象，因此核酸的提取是究的主要对象，因此核酸的提取是 分子生物学实验技术中最重要、最分子生物学实验技术中最重要、最 基本的操作基本的操作 。DNA提取的几种方法提取的几种方法染色体染色体DNA的提取的提取CTAB法法SDS法法其它其它基因组基因组DNA CTAB法法CTAB法原理（植物法原理（植物DNA提取经典方法）提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基，十六烷基三甲基 溴化

2、铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。物。该复合物在高盐溶液中（该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。出来。注：注：CTAB溶液在低于溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。基因组基因组

3、DNA CTAB法法CTAB提取缓冲液的经典配方提取缓冲液的经典配方20 mMEDTA （pH8.0 ）0.1% （V/V）使使 用前加入用前加入2%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度 -巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl （pH8.0 ）组份组份20 mMEDTA （pH8.0 ）0.1% （V/V）使使 用前加入用前加入2%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度 -巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl （pH8.0 ）组份组份Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合螯合Mg2+或或

4、Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase活性；活性；NaCl 提供一个高盐环境，使提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除CTAB提取缓冲液的改进配方提取缓冲液的改进配方5%(W/V)PVP4020 mMEDTA （pH8.0 ） 2%（V/V） 使用前加入使用前加入3%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度 -巯基乙醇巯基乙醇CTABNaCl

5、Tris-HCl （pH8.0 ）组份组份5%(W/V)PVP4020 mMEDTA （pH8.0 ） 2%（V/V） 使用前加入使用前加入3%(W/V)1.4M100 mM终浓度终浓度 -巯基乙醇巯基乙醇CTABNaClTris-HCl （pH8.0 ）组份组份PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。糖结合，有效去除多糖。CTAB法流程图法流程图植物材料植物材料裂解液裂解液上层溶液上层

6、溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNASDS法法SDS是一种阴离子去垢剂是一种阴离子去垢剂，在高温在高温（5565）条件下能裂解细条件下能裂解细 胞胞，使染色体离析使染色体离析，蛋白变性蛋白变性，释放出核酸；释放出核酸；提高盐提高盐(KAc或或NH4Ac)浓度并降低温度浓度并降低温度（冰浴冰浴），使蛋白质及多糖使蛋白质及多糖 杂质沉淀杂质沉淀，离心后除去沉淀；离心后除去沉淀；上清液中的上清液中的DNA用酚用酚/氯仿抽提氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。 SDS法原理法

7、原理 SDS法法DNA提取缓冲液提取缓冲液20 mMEDTA （pH 8.0 ）2%0.4M10 mM终浓度终浓度SDSNaClTris-HCl （pH8.0 ）组份组份20 mMEDTA （pH 8.0 ）2%0.4M10 mM终浓度终浓度SDSNaClTris-HCl （pH8.0 ）组份组份 SDS法流程图法流程图 （以动物组织为例）（以动物组织为例）动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提干燥溶解干燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液基因组基因组DNA其它方法其它方法根据细胞裂解方式的不同有：根据细胞裂解方式的不同有：物理方式物理方式：玻

8、璃珠法、：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法超声波法、研磨法、冻融法化学方式化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式生物方式：酶法：酶法根据核酸分离纯化方式的不同有：根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：吸附材料结合法：硅质材料硅质材料阴离子交换树脂阴离子交换树脂磁珠磁珠高盐低高盐低pHpH值结合核酸，低盐高值结合核酸，低盐高pHpH值洗脱。值洗脱。快捷高效。快捷高效。低盐高低盐高pHpH值结合核酸，高盐低值结合核酸，高盐低pHpH值洗脱。值洗脱。适用于纯度要求高的实验。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的

9、目的物，从而达到分离目的。物，从而达到分离目的。浓盐法浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离在盐溶液中溶解度不同，将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物基因组基因组DNA其它方法其它方法DNA提取的基本步骤提取的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离、纯化核酸分离、纯化IV.IV

10、.沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备准备 基因组基因组DNADNA的提取的提取 最好使用新鲜材料，最好使用新鲜材料，低温保低温保 存的样品材料不要反复冻融存的样品材料不要反复冻融 提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要时，要 选择有核细胞（白细胞）选择有核细胞（白细胞） 组培细胞培养时间不能过长，组培细胞培养时间不能过长， 否则会造成否则会造成DNA降解降解 含病毒的液体材料含病毒的液体材料DNADNA含量较含量较 少，提取前先富集少，提取前先富集细胞裂解细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，材料应适量，过多

11、会影响裂解， 导致导致DNA量少，纯度低量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂针对不同材料，选择适当的裂 解预处理方式：解预处理方式： 植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取核酸分离、纯化核酸分离、纯化基因组基因组DNADNA的提取的提取采用吸附材料吸附的方式分离采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提时，应提 供相应的缓冲体系供相应的缓冲体系采用有机（酚采用有机（酚/氯仿

12、）抽提时应充分混匀，但氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相 应的去杂质的方法应的去杂质的方法核酸分离、纯化核酸分离、纯化 蛋白质的去除：蛋白质的去除： 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提 使用变性剂变性（使用变性剂变性（SDSSDS、异硫氰酸胍等）、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤高盐洗涤 蛋白酶处理蛋白酶处理核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多糖的去除：多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/

13、21/2体积体积 的的5M NaCl5M NaCl，高盐可溶解多糖。，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2(1/2体积体积) )，氯苯可以，氯苯可以 与多糖的羟基作用，从而去除多糖与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用用PEGPEG80008000代替乙醇沉淀代替乙醇沉淀DNADNA：在：在500500 L DNAL DNA液中加入液中加入 200200 l 20% PEGl 20% PEG8000 8000 ( (含含1.2 M NaCl) 1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min20min

14、。核酸分离、纯化核酸分离、纯化 多酚的去除：多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂： - -巯基乙醇、巯基乙醇、 抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如加入易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它，它 们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNADNA的结合的结合 盐离子的去除：盐离子的去除： 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解核酸沉淀、溶解基因组基因组DNADNA的提取的提取当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，

15、当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀， 沉淀会更充分沉淀会更充分沉淀时加入沉淀时加入1/10体积的体积的NaOAc（pH5.2，3M），有），有 利于充分沉淀利于充分沉淀沉淀后应用沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥），让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用若长期储存建议使用TE缓冲液溶解缓冲液溶解 TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNase pH值为值为8.0，可防止，可防止DNA发生酸解发生酸解DNA提取常见问题提取常见问题 问题一：问题一：DNADNA样品不纯

16、，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续酶解和PCRPCR反应。反应。原原 因因1.1.DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多 糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质2.2.DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒 精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制 后续酶解反应后续酶解反应3.3.DNADNA中残留有金属离中残留有金属离 子子对对 策策1.1.重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋 白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂 质（具体方法见前）质（具体方法见前）2.2.重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精 充分挥发充分挥发3.3.增加增加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的 次数（次数（2 2- -3 3次）次）