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1、 种子的扩大培养及污染的检测和判别种子的扩大培养及污染的检测和判别摘摘 要要 研究杂菌的检测及在生产中的危害，学会并掌握常用的几种检测方法。本实验通过对大肠杆菌进行从活化到种子液的制备，再到扩大培养，全程理解：何时检测，如何检测以及污染杂菌对每一步的影响和涉及到实际发酵时的危害。发酵过程中，采用了染色镜检、平板检测以及肉汤培养检测相结合的方式进行杂菌检测。初步了解掌握种子制备的方法及影响种子质量的主要因素，如：温度、pH、光照、染菌等因素。学会了大肠杆菌种子液的制备方法，了解了发酵染菌的危害，以及检测发酵污染的基本方法。染菌会对生产商造成不可估量的损失，因此，操作一定要严格控制无菌。关键词关键
2、词 营养培养基 扩大培养 染色镜检 平板检测 肉汤培养检测前言前言微生物工业自从采用纯种发酵以来，产量有了很大的提高，然而防止杂菌污染的要求也更高了。人们在与杂菌污染的斗争中，积累总结出很多宝贵经验。规范了管理措施，设计了一系列的设备（例如密闭式发酵罐，培养基灭菌，无菌空气制备的设备等）和管道，应用了无菌室甚至无菌车间，建立了无菌操作技术，因而大大降低了发酵染菌率。但是某些发酵工业还遭受着染菌的威胁，染菌后轻者影响产率、产物提取的率和产品质量，重者造成“倒罐” ，不但浪费了大量的材料，造成严重的经济损失，而且还污染了环境。因此及早发现杂菌并采取相应的措施，对减少有杂菌污染造成的损失至关重要。因
3、此检查的方法要求准确、快速。发酵污染可发生在各个时期。种子培养期染菌的危害最大，应严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行彻底灭菌。1 材料和方法1.1 材料 1.1.1 实验材料大肠杆菌试管斜面菌种1.1.2 实验仪器、设备高压蒸汽灭菌 锅电热恒温水浴槽 显微镜 超净工作台 带摇床的培养箱 烧杯电子秤 接种环 酒精灯试管 三角瓶1.1.3 实验药品葡萄糖 磷酸二氢氨 硫酸镁 氯化钠 磷酸氢二钾 营养琼脂培养基 牛肉膏蛋白胨 1%酚红溶液 蒸馏水1.1.4 实验试剂营养琼脂培养基 肉汤培养基 扩大培养基1.2 方法1.2.1 培养基的配置按照下述培养基的配方称量上述物
4、质，并将它们溶解于烧杯中。营养琼脂培养基（即营养培养基）：蛋白胨 1%，牛肉膏 0.3%，NaCl0.5%，琼脂2%，PH7.2 肉汤培养基：牛肉膏 0.3%，蛋白胨 0.8%，葡萄糖 0.5%，氯化钠 0.5%，1%酚红溶液0.4%，Ph7.2.扩大培养基：葡萄糖 0.5%，NH4PO40.1% ，MgSO40.02%，NaCl 0.5%，K2HPO40.1%1.2.2 灭菌将上述配置好的培养基以及实验所需的玻璃仪器培养皿、移液管，加塞三角烧瓶、试管等放于高压蒸汽灭菌锅中，在 121 摄氏度条件下灭菌 30 分钟。1.2.3 活化及检测将保存在冰箱里的大肠杆菌试管斜面接种到营养琼脂培养基中，
5、在 37 度下培养。培养 18 个小时后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测；若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。检测方法常用染色镜检，具体操作步骤见“1.2.5 杂菌检测” 。若检测后，没有污染，便可进行扩大培养；若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。1.2.4 扩大培养 在无菌条件下，从检测后的活化培养基上选取 10 个菌落，用接种针接种到扩大培养基中，于 37 摄氏度下培养 16-18 小时。1.2.5 杂菌检测扩大培养只有在无杂菌的情况下，才能进行发酵。其检测方法常用的有三种。1.2.5.1 染色镜检用无菌操
6、作的方法取培养基中的菌落少许（若为液体培养基则用移液管吸取少量培养基） ，涂布在载玻片上，自然风干后用番红染色 12 分钟，水洗，干燥后在显微镜下观察。1.2.5.2 平板检测挑取一环菌落，用划线法，接种到平板上。或者，取少量待检测的培养液，经稀释后（一般稀释 106-107倍）涂布在平板上。分别在 37 度摄氏度下培养，培养 24 小时后，观察菌落形态，并用染色镜检法检测。1.2.5.3 肉汤培养检测用无菌操作方式取扩大培养后的菌种接种到肉汤培养基上,置于 37 摄氏度下培养24 小时，观察肉汤培养基是否变浑浊。此方法用于检测培养基灭菌是否彻底。2 结果及讨论2.1 种子的扩大培养在活化培养
7、基上长出大量菌落，且菌落颜色单一，均为黄色。挑取边缘菌落及形态一致的菌落少量，制作装片，染色后在显微镜下观察，发现多个视野中都为杆菌，可初步鉴定出活化的菌种中没有污染杂菌。选取没有污染杂菌的菌落，用无菌操作技术接种，进行扩大培养。在适宜条件下培养 16h 后，得到了大肠杆菌的种子液，吸取该种子液在显微镜下观察到有大量的大肠杆菌。2.2 染色镜检镜检时，多个视野中均观察到了大肠杆菌，没有观察到球菌或其他的细菌，因此可初步认为该种子液中没有感染杂菌。但也可能是由于吸取的菌液量有限，而且观察的视野较小，杂菌数本身也少，导致没有观察到。因此，为了更准确的检查菌液中是否由杂菌，还需进一步实验来证明。2.
8、3 平板检测从营养琼脂培养基上长出的菌落的形态上看，没有不同形态的菌落，可简单说明菌液中没有污染杂菌。但可能是由于大肠杆菌为优势菌种，限制了杂菌的生长，因此杂菌的菌落较小，用肉眼看不到。为了进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌一样，则可确认没有污染杂菌；否则则污染了杂菌。此方法适合固形物多的发酵液，而且形象直观，肉眼可见，不需仪器。但需严格按照无菌操作技术，所需时间较长，而且无法区分形态与生产菌相似的杂菌。在污染的前期，生产菌占绝大多数，污染菌数量较少，所以要做比较多的平行试验才能检测出污染菌。2.4 肉汤培养检测将培养液接入肉汤中培养后，未见肉汤培养基变浑浊，则可
9、确证该培养基灭菌彻底，没有污染杂菌。若在以后的培养液中发现有杂菌存在，则可排除是由于培养基灭菌不彻底，而造成了污染，可能是由于接种时操作不规范，而导致杂菌污染。此方法主要用于空气过滤系统的无菌检测。还可用于检查培养基灭菌是否彻底，只需少量培养基接入肉汤中，培养后看肉汤的混浊程度，有时也可看颜色变化.3 结论本实验用营养培养基将种子活化后，接入扩大培养基中，制备出大肠杆菌种子液，通过染色镜检、平板检测、肉汤培养检测的进一步检查，确定在接种过程中种子培养液是否污染杂菌。 若培养液未污染杂菌，说明该菌种可进一步扩大培养，用于生产。若在发酵液或发酵容器中侵入了杂菌，及早发现杂菌污染并采取相应的措施，对
10、减少由杂菌污染造成的损失至关重要。通过本试验我们了解了种子制备的方法以及发酵染菌的危害，也学会了检测发酵染菌的基本方法：细胞形态的对比；菌落形态的对比；微生物生长浊度的观察；发酵参数的判断。我们深刻地体会到了种子制备是发酵生产的第一道也最重要的工序，优良菌种不仅可以缩短周期，也可以稳定产量、提高设备利用率。 参考文献参考文献1吴根福，杨志坚.发酵工程实验指导，2005，5（1）：4648.2全国食品发酵标准化中心.中国食品工业标准汇编.北京：中国标准版社，20003姚汝华，发酵工程工艺原理，广州：华南理工大学出版社，19964李艳，发酵工程概论，北京：中国轻工业出版社，19995焦瑞身，微生物工程，北京：化学工业出版社，20036吴松刚，微生物工程概论，北京：科学出版社，2004
