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1、Mycosystema 菌 物 学 报 15 July 2009, 28(4): 504- ISSN1672-6472 CN11-5180Q 2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.*Corresponding author. E-mail: 收稿日期: 2008-09-19, 接受日期: 2009-01-19 银杏叶部内生真菌多样性的研究杜少康 陈双林* 林岱 吴鸣谦 王梅霞南京师范大学生命科学学院 南京 210046摘 要：为了解我国特有植物银杏的叶部组织中内生真菌菌群的多样性和演替变化，分别于春、夏、秋季从江苏和山
2、东两省的五个主要银杏栽培地采集健康叶片进行了内生真菌的研究。结果表明：所分离出的 1971 株内生真菌可归于 32 属，以交链孢属 Alternaria（18.01%）、叶点霉属 Phyllosticta（14.66%）和丝核菌属 Rhizoctonia（14.56%）为优势菌群。在内生真菌的类群及组成上存在着部位、地区以及季节的差异性，也呈现一定的规律性。多样性指数的计算反映出所获得的银杏叶部内生真菌菌群具有不同的丰富度及均匀度，同时有一定的相似性。关键词：分离率，分离频率，优势菌群，多样性指数，相似性系数Diversity of endophytic fungi in leaves of
3、Ginkgo bilobaDU Shao-Kang CHEN Shuang-Lin* LIN Dai WU Ming-Qian WANG Mei-XiaCollege of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210046, ChinaAbstract: Diversity of endophytic fungi in leaves of Ginkgo biloba was studied in order to understand diversity state and succession change of endophyt
4、ic fungal communities in this endemic plant. Healthy leaf samples were collected from five main planting locations of G. biloba in Jiangsu and Shandong provinces separately in spring, summer and autumn. A total of 1971 strains of endophytic fungi was isolated. As a result of morphological identifica
5、tion 32 genera were obtained, of which Alternaria (amounting to 18.01% of the total), Phyllosticta (14.66%) and Rhizoctonia (14.56%) were dominant. The distribution and composition of endophytic fungi varied with plant organs colonized, localities and seasons, but they assumed regularity to a certai
6、n extent. Populations of endophytic fungi in different parts of the leaves indicated different abundance and uniformity but assumed similarity to a certain extent.Key words: isolation rate, isolation frequency, dominant population, diversity index, similarity coefficient从de Bary在1866年指出植物中存在有内生微生物，特
7、别是从上个世纪80年代至今，大量的植物内生真菌资源被发掘出来，从而也证实了内生真菌在植物体内是普遍存在的（郭良栋 2001） 。从不同植物中分离到的内生真菌数量不同，Fisher et al.（1993）从光叶大戟Eucalyptus nitens MaidenVol.28 No.4 505http:/ 1991） ，因此，选择特有植物根据分离率分析内生真菌的特定组成和演替变化、运用多样性指数来评价其内生真菌的丰富度将有助于植物内生真菌多样性研究的深入。银杏Ginkgo biloba L.是单科单属单种的多年生落叶乔木，为我国特有树种。其内生真菌的研究主要是由国内一些研究者开展，且主要集中在生
8、物活性菌株的研究上，如对与宿主银杏相似的黄酮类化合物产生菌的分离和鉴定（王梅霞等 2004；韩晓丽等 2008） ，对产香的银杏内生镰刀菌G1024菌株的生物学特性和挥发性成分的研究（蒋继宏等 2004；鞠秀云等 2006） ，对银杏内生真菌抑菌活性的研究（申屠旭萍等 2006，2007）等。在银杏内生真菌的多样性研究上，周松林等（2006）采用随机引物扩增多态性技术分析了银杏内生刺盘孢的遗传多样性，甘金莲等（2007）探讨了银杏内生真菌生态分布的一些特征，樊有赋等（2007）则研究了银杏内生真菌的种群多样性。本研究在江苏和山东两省的主要银杏栽培基地分别于春、夏、秋三季定点随机采样，通过菌种分
9、离和鉴定以及分离率和多样性指数计算，分析了银杏叶部组织中内生真菌的组成、多样性和分布特征。1 材料与方法1.1 材料分别于 2007 年春季（5 月） 、夏季（8 月）及秋季（11 月）在 5 个样点（表 1）采集银杏叶样品。在每一采样地点，随机选取相隔一定距离的若干健康的银杏植株采样。样品标记后置于保鲜袋中，于 4保存，在 12h 之内对样品进行内生真菌的分离。1.2 培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200g，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水 1000mL，pH 值自然，临用时加 250mg/L 链霉素。1.3 内生真菌的分离、纯化及保藏采用常规的真菌组织分离法（方中达 199
10、8） 。叶片剪成 0.5cm0.5cm 左右的组织小块，叶柄剪成 1cm 长的小段。每次分离均选取叶片组织块200 个，叶柄组织块 50 个。表1 银杏叶组织采样地点及其生境Table 1 Sampling site and habitat of the leaves of Ginkgo biloba采样地点Sampling site采样生境Habitat江苏南京Nanjing, Jiangsu公园Park江苏泰兴Taixing, Jiangsu种植园Plantation江苏启东Qidong, Jiangsu公园Park江苏邳州Pizhou, Jiangsu种植园Plantation山东郯城T
11、ancheng, Shandong种植园Plantation1.4 内生真菌的鉴定依照真菌的经典分类鉴定方法，从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片，置于光学显微镜下观察菌丝、有性或无性孢子、产孢结构等的形态特征，鉴定到属。真菌分类鉴定的工具书主要为真菌鉴定手册（魏景超 1979），半知菌的鉴定则主要依据Barnett Sum., Summer; Aut., Autumn; NJ, Nanjing; TX, Taixing; QD, Qidong; PZ, Pizhou; TC, Tancheng.表2 银杏叶部内生真菌的类群组成Table 2 The composition of endo
12、phytic fungi in leaves of Ginkgo biloba纲目科属分离率（%）分离频率（%）ClassOrderFamilyGenusIsolation rate (%)Isolation frequency (%)青霉属 Penicillium1.472.79木霉属 Trichoderma0.671.27曲霉属 Aspergillus0.450.86拟青霉属 Paecilomyces0.030.05头孢霉属 Cephalosporium0.160.30葡萄孢属 Botrytis0.350.66短梗霉属 Aureobasidium0.751.42丛梗孢科Moniliacea
13、e合计3.887.35瘤座菌科Tuberculariaceae镰孢属 Fusarium1.392.64单格孢属 Ulocladium0.050.10匐柄霉属 Stemphylium2.614.97交链孢属 Alternaria9.4718.01黑孢属 Nigrospora0.531.01链毛孢属 Streptothrix0.430.81色串孢属 Torula1.552.94丛梗孢目Moniliales暗梗孢科Dematiaceae合计14.6427.84叶点霉属 Phyllosticta7.7114.66拟茎点霉属 Phomopsis2.725.18壳二孢属 Ascochyta0.430.81
14、色二孢属 Diplodia0.130.25闭果霉属 Sclerotiopsis0.851.62壳变孢属 Hendersonula1.011.93核座孢属 Plenodomus1.522.89射盾孢属 Actinopelte1.122.13壳单孢属 Amerosporium0.721.37球壳孢科Sphaeropsidaceae合计16.2130.84球壳孢目Sphaeropsidales裂壳孢科Excipulaceae刺毛壳孢属 Dinemasporium0.080.15刺盘孢属 Colletotrichum2.274.31盘长孢属 Gloeosporium3.396.44黑盘孢目Melanc
15、oniales黑盘孢科Melanconiaceae合计5.6610.75丝核菌属 Rhizoctonia7.6514.56小菌核属 Sclerotium0.270.51半知菌Fungi Imperfecti无孢目Agnomycetales 丝葚霉属 Papulospora0.080.15508 Mycosystema合计8.0015.22子囊菌Ascomycetes座囊菌目Dothideales座囊菌科Dothideaceae黑腐菌属 Guignardia0.080.15续表 2日规壳菌科Gnomoniaceae小丛壳属 Glomerella0.050.10 球壳菌目Sphaeriales毛壳菌科Chaetomiaceae毛壳菌属 Chaetomium1.122.13无孢菌群 Sterile mycelium1.472.79表3 不同地区银杏叶部内生真菌菌群主要类群的比较Table 3 The co
