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1、第三节第三节 核酸的理化性质核酸的理化性质 和研究方法和研究方法 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 一、核酸的一般性质一、核酸的一般性质 1. 状态：状态： 核苷酸为无色晶体或粉末核苷酸为无色晶体或粉末, DNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体， RNA为白色粉末。为白色粉末。 2. 分子大小：分子大小： 核苷酸分子量：核苷酸分子量： 1个脱氧核苷酸对个脱氧核苷酸对 618D. DNA和和RNA皆是高分子量物质。皆是高分子量物质。 College of Life Sciences, CNUCollege of
2、 Life Sciences, CNU DNA分子粘度要比分子粘度要比RNA大得多。大得多。 粘度大小：粘度大小：线性分子线性分子 不规则线团不规则线团 球形分子球形分子 4. 溶解性：溶解性： 核苷酸易溶于水，核苷酸易溶于水，DNA、RNA微溶于水，皆微溶于水，皆不溶不溶 于有机溶剂。于有机溶剂。 3. 粘度：粘度： 核酸钠盐比游离酸易溶于水。核酸钠盐比游离酸易溶于水。 变性变性DNA粘度下降粘度下降。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 核酸的溴化乙锭（核酸的溴化乙锭（EB）染色）染色 EB是一种荧光染料，可
3、插入核酸相邻碱基对之间。是一种荧光染料，可插入核酸相邻碱基对之间。 在紫外灯下，结合在紫外灯下，结合EB的核酸呈橙红色荧光。的核酸呈橙红色荧光。灵敏度灵敏度 为为10ng。 5. 特殊颜色反应特殊颜色反应 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU Gelred是由美国是由美国Biotium公司研公司研发的高灵敏、高稳定、低毒性发的高灵敏、高稳定、低毒性的荧光核酸凝胶染色试剂。的荧光核酸凝胶染色试剂。 Gelred染色原理同染色原理同EB，是一种，是一种DNA插入式染料，但是它同时插入式染料，但是它同时解决了解决了EB本
4、身存在的缺陷，例本身存在的缺陷，例如高诱变性和高背景信号等。如高诱变性和高背景信号等。 GELred 染色染色 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 6. 旋光性旋光性 核酸分子是核酸分子是高度不对称的，具旋光性高度不对称的，具旋光性。 核酸核酸变性，比旋值下降。变性，比旋值下降。 DNA的比旋值的比旋值 D = + 150（右旋）（右旋） 7. 紫外吸收紫外吸收 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，所以碱基、核苷、，所以碱基、核苷、 核苷酸、核酸在核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸
5、收，最处有强烈的紫外吸收，最 大吸收峰在大吸收峰在260nm处。处。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU pH 7.0 下核苷酸的吸收光谱和摩尔消光系数下核苷酸的吸收光谱和摩尔消光系数 259nm 252nm 262nm 267nm 271nm College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU （1）定性定量鉴定各种核苷酸）定性定量鉴定各种核苷酸 应用：应用： （2）核酸纯度鉴定）核酸纯度鉴定 纯纯DNA: A260 / A280 1.8 纯纯R
6、NA: A260 / A280 = 2.0 （3）核酸纯品定量鉴定）核酸纯品定量鉴定 A260 =1, 相当于相当于 50 g / ml 双螺旋双螺旋DNA 40 g / ml 单链单链DNA（RNA） 20 g / ml 寡核苷酸寡核苷酸 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 二、核酸的水解二、核酸的水解 1. 酸水解酸水解 2. 碱水解碱水解 RNA可被碱水解为核苷酸。可被碱水解为核苷酸。DNA不具不具2-OH, 不不能形成碱水解的中间物，能形成碱水解的中间物，所以所以DNA抗碱。抗碱。 糖苷键和磷酸酯键糖苷键
7、和磷酸酯键皆可以被酸水解。皆可以被酸水解。 稀盐酸稀盐酸 可水解嘌呤糖苷键可水解嘌呤糖苷键; ; 水解嘧啶糖苷键需要高温和水解嘧啶糖苷键需要高温和 强酸条件（甲酸等）。强酸条件（甲酸等）。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 碱性条件下碱性条件下RNA的水解的水解 2 , 3 -环式核苷酸环式核苷酸 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 核酸酶（核酸酶（nuclease） 核糖核酸酶核糖核酸酶 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 例如：例如
8、： 核酸内切酶核酸内切酶 核酸外切酶核酸外切酶 根据根据 底物底物 根据根据作作 用方式用方式 蛇毒磷酸二酯酶蛇毒磷酸二酯酶/牛脾牛脾磷酸二酯酶磷酸二酯酶 3. 酶水解酶水解 DNA内切酶内切酶 RNA 内切酶内切酶 外切酶外切酶 核糖核酸酶核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶 DNase、DNase 限制性限制性核酸内切酶核酸内切酶 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 蛇毒磷酸蛇毒磷酸 二酯酶二酯酶 牛脾磷酸牛脾磷酸 二酯酶二酯酶 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶的切割位点蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸
9、二酯酶的切割位点 （外切酶）（外切酶） College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 牛胰牛胰RNase的切割位点的切割位点 产物为产物为3 - 嘧啶核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸嘧啶核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸 （RNA内切内切酶）酶） College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU a: DNase，产物为，产物为5 - 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸 b: DNase ，产物为，产物为3 - 核苷酸，或以其为尾的寡核苷酸核苷
10、酸，或以其为尾的寡核苷酸 DNase和和DNase 的的切割位点切割位点 （DNA内切内切酶）酶） College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease） 特点：特点： （1）专一性强（识别序列具特殊的）专一性强（识别序列具特殊的回文结构回文结构） （2）切割后的）切割后的DNA片段具片段具粘末端或平末端粘末端或平末端 是一类能识别双链是一类能识别双链DNA分子中分子中特定核苷酸序列特定核苷酸序列，并由此切断并由此切断DNA双链的核酸内切酶。双链的核酸内
11、切酶。 应用：应用： DNA体外重组的重要工具酶体外重组的重要工具酶 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 粘末端粘末端 平末端平末端 限制性内切酶限制性内切酶 对外源对外源DNA片片 段进行切割段进行切割 DNA片段片段 定向插入定向插入 质粒载体中质粒载体中 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 三、核酸的酸碱性质三、核酸的酸碱性质 核苷酸、核苷酸、DNA和和RNA含有含有磷酸磷酸基基和和碱基，是两性电解质碱基，是两性电解质。 多核
12、苷酸多核苷酸中，磷酸基中，磷酸基pK1 =1.5， 因其酸性较强，所以因其酸性较强，所以核酸表现为核酸表现为 酸性酸性。 常用常用电泳法电泳法分离鉴定核酸分子。分离鉴定核酸分子。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳 核酸分子碱性环境下（核酸分子碱性环境下（pH8.0）带）带负电荷，在电场中负电荷，在电场中 向正极移动向正极移动。 核苷酸中核苷酸中 碱碱基的解离基的解离 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU
13、 在在碱性环境下（碱性环境下（pH8.0）碱基不）碱基不带电带电(C, A, G)或带负电或带负电(T)，而而 磷酸磷酸基团带基团带负电，负电，在电场在电场中核酸中核酸分子向正极移动分子向正极移动。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU (1) 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳以琼脂糖为支持物。常用水平板电泳。 对核酸分子的分离主要依据对核酸分子的分离主要依据分子大小分子大小和和分子构型分子构型， 凝胶浓度凝胶浓度对分离效果也有影响。对分离效果也有影响。 分子大小分子大小：线性：线性D
14、NA的迁移距离的迁移距离(迁移率迁移率) 与分子大小与分子大小 (碱基对碱基对, bp) 的对数成反比。的对数成反比。 分子构型：分子构型：泳泳动动速度速度 超螺旋超螺旋DNA 线性线性DNA 开环开环DNA 凝胶凝胶浓度浓度: 同一同一DNA片段在不同凝胶浓度中的泳动速度不同，片段在不同凝胶浓度中的泳动速度不同， 应选择适宜的凝胶浓度。应选择适宜的凝胶浓度。 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 琼脂糖的浓度琼脂糖的浓度 （%） 线性线性DNA大小范围大小范围 （Kb） 0.3 60 5 0.6 20 1 0.7
15、 10 0.8 0.9 7 0.5 1.2 6 0.4 1.5 4 0.2 2.0 3 0.1 迁移率与碱基对的关系迁移率与碱基对的关系 缓冲液：缓冲液：0.5 TBE , 电泳条件电泳条件:1V/cm, 16h 琼脂糖浓度与可分离片段大小琼脂糖浓度与可分离片段大小 的关系的关系 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 不同分子构型不同分子构型的的DNA的迁移率的迁移率 直线直线DNA（lineal DNA） 共价闭环共价闭环DNA (Covalently closed circular DNA, cccDNA) 开环的双链环状开环的双链环状DNA （open circular DNA） College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 侧侧 视视 俯俯 视视 样品槽模板（梳子）样品槽模板（梳子） 凝胶托盘凝胶托盘 凝胶凝胶 凝胶托盘凝胶托盘 样品槽样品槽 水平凝胶电泳示意图水平凝胶电泳示意图 College of Life Sciences, CNUCollege of Life Sciences, CNU 琼脂糖琼脂糖凝胶水平电泳凝胶水平电泳示意图示意图 适于适于分离分离0.2 20
