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1、 肺炎支原体肺炎的诊断肺炎支原体肺炎的诊断空军总医院 刘春灵支原体是介于细菌和病毒之间的一类缺乏细胞壁、呈高度多型性、能通过滤菌器、可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物。迄今分离到的支原体已达 150 余种，已确定与人类疾病关系最大的有 3 种，肺炎支原体（mycoplasma pneumonia, MP）是其中的一种。MP 在国内外都是儿童和成人呼吸道感染的重要病原体之一，主要导致肺炎，所有肺炎的 15-20%，约 50%的儿童和青少年肺炎是由 MP 引起的.因此 MP 肺炎（MP pneumonia,MPP）是常见病和多发病。但迄今为止，MPP 仍缺乏快速、可靠的诊断试验，因而
2、临床确诊困难。MPP 的诊断包含两个层面：临床诊断（经验性）和结合了实验室病原学检测的确定诊断。一、MPP 临床诊断：根据流行病学、临床症状、体征、实验室辅助检查等特点经验性综合判断而出。MPP 有着不同于一般感染性疾病的的特点：一般肺炎多发于冬季，MPP 一年四季均可发病，但多发生于夏秋季节；临床症状大多只有发热和咳嗽；外周血白细胞总数大多不高；疾病早期 X 线检查即可出现肺炎，约 10%-20%的病例会出现肺不张；因 MP 无细胞壁，临床常用的、作用于细胞壁的、安全性高的治疗肺炎的药物如 -内酰胺类的青霉素类、头孢类抗生素对其无作用；因此易被误诊为病毒性肺炎。综合上述特点，可作出初步的经验
3、性临床诊断。二、实验室病原学诊断：包括直接病原体检测和血清学检测。下面介绍几种常用或经典的 MP 实验室诊断方法。（一）直接病原体检测：主要有 MP 分离培养和聚合酶链反应（PCR）法检测 MP-DNA。检测用标本可取自可疑患者呼吸道的痰、咽拭子、鼻咽吸出物、支气管肺泡灌洗液、胸水等。1、MP 分离培养与鉴定： MP 很挑剔，培养基的营养要求比一般细菌高，生长速度慢，较一般细菌难培养；分离培养需要 10-14 天，而通常需要 2-5 周才能生长成肉眼可见的菌落。通过生化反应和免疫学方法进行鉴定。还有其它影响因素，如 MPP 无细胞壁，对环境的影响更为敏感，易被灭活；标本采集后接种到培养基的过程
4、也是培养可能失败的一个环节。由于其费时、费力、阳性率低，实际临床已经弃用此方法，目前主要用于研究性项目。2、PCR 法检测 MP-DNA：PCR 是一种模拟体内 DNA 复制的体外扩增法，以其灵敏性、特异性高，检测所需时间短，能够直接从标本中检出病原体并可定量及分型，已广泛应用于各种感染性疾病的诊断中，如 SARS、禽流感、A/H1N1流感的确诊都主要用此方法。常用于 MP 检测的是双引物两次扩增反应的套（巢）氏 PCR（nested PCR，nPCR）和基于荧光能量传递技术的实时定量 PCR（real-time quantitative PCR） ，其中实时定量 PCR 可以检测到少于 5
5、个基因拷贝的MP。美国 1996 年的一次 MP 感染暴发的流行病学调查，对部分患病者的呼吸道分泌物以 PCR 检测 MP-DNA 阳性率为 57%，同样患者的 MP 培养阳性率仅 5%。3、直接镜检：MP 没有细胞壁而没有固有型态而呈高度多型性，且革兰氏染色不易着色，因此难于用光学显微镜观察。（二）血清学检测：检测 MPP 患者血清抗体有多种方法，传统、经典和常用的有 4 种，为冷凝集试验、补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验。1、冷凝集试验（CA）: MP 感染后患者血清中产生一种非特异性冷凝集素（IgM 型） ，可能是 MP 作用于红细胞型抗原，使其变性后产生的自身抗体。将患者的
6、稀释血清与人 O 型红细胞混合，4过夜，观察红细胞凝集现象，放37后其凝集现象消失，故称为冷凝集试验。Garrow 建立了一种快速方法：取0.2ml 全血，加 0.2ml 3.8%枸橼酸纳混合，置于 0-4冰箱中 15-30 秒取出，倾斜试管观察凝集情况，如有粗大絮状颗粒是为阳性。仅有 50%左右的 MPP 患者冷凝集试验阳性，一般在发病一周末或第二周开始时出现，2-3 月后消失。但传染性单核细胞增多症、流感、风疹、腮腺炎、腺病毒感染和其他病毒性疾病也可出现低效价阳性，因此冷凝集试验的特异性不高，只能作为辅助诊断指标。2、补体结合试验（CF）:补体结合试验是一种传统的免疫学技术，是用免疫溶血机
7、制做指示系统，来检测另一反应系统抗原或抗体的试验。如试验血清中不含抗体，则补体不被结合，在指示系统中能引起溶血；如有抗体存在，则指示系统不发生溶血。早在 1906 年 Wasermann 就将其应用于梅毒的诊断，即著名的华氏反应。CF 的优点是：灵敏度高：补体活化过程有放大作用。特异性强：各种反应成分事先都经过滴定，选择了最佳比例，出现交叉反应的机率较小。但是补体结合试验参与反应的成分多，影响因素复杂，操作步骤繁锁并且要求十分严格，稍有疏忽便会得出不正确的结果，所以多已被其他更易被接受的方法所取代。对于MPP 患者，补体结合试验检测的主要是 MP-IgM 抗体。3、间接血凝试验：是以红细胞作为
8、载体的间接凝集试验。其原理是将吸附了MP 抗原的鞣化绵羊红细胞与待检血清中相应抗体作用，出现肉眼可见的凝集现象。间接凝集反应具有快速、敏感、操作简便、无需特殊的实验设备等特点。间接凝集试验又称被动凝集试验。我国应用最多的商业血清学诊断试剂盒是日本富士肺炎支原体抗体检测试剂盒（被动凝集法） （SERODIA-MYCO） ；也称为“微量颗粒凝集试验试剂盒（PA） ” ，原理是用明胶粒子代替动物红细胞作为载体，是间接血凝试验的改良产品。 厂家在国内外都称检测的是MP-IgM 抗体。4、酶联免疫吸附试验（ELISA）：它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应， 可进行定
9、性、半定量和 定量测定。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象 ，以及抗原抗体反应 的高度的特异性 ，使 ELISA具有高敏感性、特异性强的特点 ，还有重复性好、操作简便等，是免疫学检验中最为常用的方法之一。但 ELISA 的影响因素较多，且必须的酶标仪价格不菲，可能因此制约了 ELISA 法在医院常规 MP 抗体检测中的普及性应用。（三） 、病原学检测结果的临床解读：MP 感染与一般的感染性疾病有很多不同，上述任何一种实验室病原学诊断方法的一次检测的阳性结果都不能确定提示 MP 急性感染。1、直接自病灶中检出病原体被认为是感染性疾病的金标准诊断方法
10、.但 MP感染有所不同，存在无症状 MP 呼吸道携带者等，以及患者病愈后数周至数月其痰中仍可培养出 MP，辛德莉等报道即使正规抗生素治疗痊愈后口咽部带 MP 最长达 4.5 个月。因此呼吸道分泌物的 MP 分离培养和 PCR 检测 MP-DNA 的阳性结果也可见于既往感染者和 MP 携带者。不是检验方法的问题，是呼吸道分泌物标本 MP 的存在与机体 MP 感染疾病状态的不一致，导致了金标准的 MP 培养及快速、高敏感性、高特异性的 PCR 方法检测结果的临床不可靠性。2、传染病急性感染时IgM抗体首先出现，在血液中存在一般不超过3个月，尤其大多数病毒性传染病如麻疹患病后获终身免疫不会得第二次麻
11、疹，因而特异性IgM抗体阳性即可确诊为急性感染。但多个研究表明，MP感染后MP-IgM可持续存在1年最长可达9年；而很多人尤其儿童一年可多次呼吸道感染，因此单次MP-IgM阳性并不能区分哪一次呼吸道感染是由MP引起的而无实际临床意义。在我们对儿童MPP的研究中发现，3例3个月到3年后复查MP抗体仍1：1280，提示单份血清抗体高滴度也不能确定提示急性MP感染。3、双份血清特异性抗体滴度 4 倍及以上升高是感染性疾病最可靠的病原学确诊方法之一，以往常取急性期血清及发病 2-3 周后的恢复期血清平行检查，因此主要用于回顾性诊断。由于 MP 感染的特性，双份血清 MP 抗体滴度 4 倍及以上升高（无
12、论何种方法）在目前是急性 MP 感染唯一可靠的实验室病原诊断方法，确定是全身性急性 MP 感染（包括隐性感染） 。近几年国内外权威机构逐渐认可了这个情况并写入教科书、国家级指南及应用于了相关研究中1-5。我们曾以此方法对确诊的成人病例进行回顾性分析，其临床表现呈现出了规律性6 ,临床对 MP 感染的经验性诊断的准确率显著提高。我们在临床研究中发现，双份血清方法临床应用的局限性过大与第二份血过于强调在恢复期采集有关。我们发现以间接血凝试验检测 MP 抗体，成人最早起病第 6 天；儿童最早起病第 8 天采集第二份血清检测 MP 抗体即可出现抗体滴度的 4 倍及以上升高而确诊 MPP.而患者（儿）大
13、多在起病 4-5 天门诊治疗效果不佳而做胸部 X 线检查发现肺炎时住院，因此双份血清的方法有实用性。病例的确诊对临床诊治也有比较大的帮助的，首先在面对在大环内酯类抗生素治疗多日仍持续高热与病毒性肺炎难鉴别时，因 MP 是儿童和青少年非典型肺炎最常见病原体之一，而病毒性肺炎大多缺乏临床实验室检测手段，因此反复检测 MP 抗体，确认或否定 MP 感染的诊断对鉴别诊断和制定治疗方案有利，尤其对于感染了大环内酯类耐药 MP 菌株的儿童，能够确诊 MPP 而给予正确的治疗可能会避免一些病情严重患儿的死亡。第二，即使确诊时患者已处于恢复期，一线临床医生因此得到了正确的经验，提高了经验型诊治水平。第三，由于
14、MPP 可能复发，尤其是儿童，确诊后可以适当延长抗生素治疗时间，可能也因此会减少一些病愈后呼吸道带菌者和降低带菌浓度，减少疾病的传染源。总之，双份血清抗体滴度 4 倍及以上升高（无论何种方法）是 MP 现时感染最可靠的、在目前是唯一的实验室确诊方法。MP 抗体检测方法中以 ELISA 法和间接血凝试验敏感性、特异性较好且操作简便而较适宜临床应用。尽早采血标本进行第一次 MP 抗体检测，儿童在起病 8 天后、成人在起病 6 天后即可第二次采血复查 MP 抗体。参考文献1.David Schlossberg.Mycoplasmal infection.In: Lee Goldman,Dennis
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