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1、 人参单体人参单体Rh2 诱导人肺腺癌诱导人肺腺癌A549/ DDP细胞凋亡的体外研究细胞凋亡的体外研究周东波 胡成平 苏晓丽 杨红忠作者单位:长沙,中南大学湘雅医院呼吸内科出处：中国肺癌杂志 2005 年 8 月第 8 卷第 4 期 Chin J Lung Cancer , August 2005 , Vol . 8 , No. 4【摘要摘要】 背景与目的背景与目的 肺癌已成为人类癌症主要死亡原因之一。从植物中开发抗肿瘤药物是国内外抗肿瘤新药开发的一个热点。本研究的目的是观察人参单体Rh2 诱导人肺腺癌A549/ DDP 细胞系凋亡的作用,并探讨其可能的分子机制。方法方法 体外培养的人肺腺癌
2、A549/ DDP 细胞经不同浓度梯度的人参单体Rh2干预,分别应用MTT 实验观察其对细胞增殖的影响,用流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数及相关基因表达的改变,以及用双抗体夹心EL ISA 法测定细胞上清液sApo21/ Fas 浓度变化。结果结果 人参单体Rh2 可抑制A549/ DDP 细胞的生长,并呈剂量、时间依赖作用。人参单体Rh2 处理A549/ DDP 细胞24 h ,实验组凋亡指数显著高于对照组( P 0. 05) 。实验组p53 、Fas 阳性表达率显著高于对照组( P 0. 05) . The positive expression rate of p53 and Fas i
3、n t rial group was significantly higher than that in cont rol group ( P 0. 05) 。2. 3 G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系凋亡相关基因阳性表达率的影响 实验组A549/ DDP 细胞p53 阳性表达率35. 5 %显著高于对照组27. 8 %( P 0. 01) , Fas阳性表达率70. 4 %显著高于对照组20. 5 % ( P 0. 001) ,Bcl22 阳性表达率36. 8 %显著低于对照组55. 4 %( P 0. 001) 。2. 4 G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系细胞培养上清液sA
4、po21/ Fas 含量的影响 实验组A549/ DDP 细胞培养上清液于不同时间的sApo21/ Fas 含量均显著低于对照组( P 0. 05) (表2) 。3 讨论讨论研究发现,虽然大多数化疗药物都具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用,但化疗药物的毒副作用限制了其临床应用,而植物抗癌成份倍受人们关注。人参( Panaxginseng C. A. Meyer) 为五加科多年生草本植物,现代医学表明人参具有抗肿瘤、抗衰老、抗辐射等多种生物学活性5 。G2Rh2 属于二醇组皂甙,是由人参中提取的天然活性成分,近年来体内外实验证实,它可以通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖与生长,如卵巢癌、黑色素瘤、前列
5、腺癌、神经胶质瘤等,并证明其对正常组织毒性甚低,但G2Rh2 能否诱导人肺腺癌A549/DDP 细胞的凋亡,国内外尚未见报道。表表2 G2Rh2 对A549/ DDP 细胞系细胞培养上清液sApo21/ Fas 含量的影响(ng/ L)Tab 2 The effect of G2Rh2 on the level of sApo21/ Fasin A549/ DDP cell culture supernatant (ng/ L)GroupTime24 h 48 h 72 hCont rol group 15. 65 2. 13 16. 37 3. 45 18. 34 1. 25Trial gr
6、oup 8. 64 1. 52 10. 66 3. 24 12. 74 2. 88P value 0. 05 0. 05 0. 05本研究结果提示,G2Rh2 可诱导细胞形态学发生改变,诱导细胞凋亡,影响细胞的增殖活力,抑制其生长,且这一变化在实验范围内呈现剂量、时间依赖性作用。于广久等6 观察了G2Rh2 对人喉癌细胞株Hep22 的抗增殖作用。李殿友等4 在检测Rh2 对C6 胶质瘤细胞增殖率的实验中,不同浓度(2 、4 、8mol/ L) 的Rh2 对C6 细胞的增殖抑制作用随剂量增加和时间延长而明显增强,台盼蓝排斥实验证实C6 细胞存活百分率不论实验组还是对照组均大于90 %,实验结果
7、说明Rh2 可明显抑制体外C6 胶质瘤细胞的增殖,且在实验剂量范围内没有明显毒性。我们的实验结果与其报道相一致。近年来研究发现许多抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞的G0 / G1 期。Lee 等7 用流式细胞仪检测G2Rh2 体外抑制肝癌细胞SK2HEP21 增殖的实验表明, G2Rh2能够使细胞阻滞于G1 期,滞留于G1 / S 关卡处,阻止其向S 期发展。Ota 等8 也报道G2Rh2 能够使黑色素瘤细胞B16 发生G1 期阻滞,细胞周期的进行受阻。本实验用流式细胞仪检测也显示, G2Rh2 以细胞毒性作用不明显的剂量作用于A549/ DDP 细胞24 h 以后,实验组的凋亡指数明显高于对照组,
8、G0 / G1 期细胞较对照组明显增多,而S 期细胞数目减少,提示G2Rh2对A549/ DDP 细胞的周期调控作用主要发生于G1期,阻止其向S 期发展,可将细胞阻滞于G0 / G1 期,从而抑制其DNA 合成。目前研究表明,诱导细胞凋亡的因素很多,不同的因素诱导细胞凋亡的信号传导途径不同9 ,p53 、Fas、Bcl22 基因是较早确定的凋亡调节基因。肺癌的发生、发展与多种凋亡基因相关,如p53 缺失或表达异常,Fas、Bcl22 基因表达异常 10 。为了探讨G2Rh2 的作用机制,我们检测了凋亡相关基因的阳性表达率。本研究实验组A549/ DDP 细胞p53 、Fas 基因阳性表达率较对
9、照组升高,Bcl22 基因阳性表达率较对照组下降。因此我们推测G2Rh2 可能通过上调p53 和Fas 基因及下调Bcl22 基因而诱导A549/ DDP 细胞凋亡。Apo21/ Fas 是一种细胞表面诱导凋亡的分子,也称为CD95 ,相对分子量为44 600 ,系跨膜糖蛋白,属于肿瘤坏死因子受体( TNFR) 与神经生长因子受体(N GFR) 超家族成员,是一个细胞凋亡信号受体,可以诱导Apo21/ Fas 蛋白所在的细胞凋亡11 。正常肺泡细胞上皮及肺癌细胞中均有Fas 表达12 ;Apo21/ Fas配体(Apo21/ Fas ligand , Apo21/ FasL) 是一种型跨膜蛋白
10、,与TNFR 家族有同源性,Apo21/ FasL 主要表达于活化的T 细胞、N K 细胞表面。Apo21/ Fas 与Apo21/ FasL 结合是Apo21/ Fas 在体内发挥作用的唯一途径。Apo21/ Fas 受体有两种形式: 膜型Apo21/Fas ( mApo21/ Fas ) 和可溶型Apo21/ Fas ( sApo21/Fas) 。细胞表面的mApo21/ Fas 通过与Apo21/ FasL结合而激发Apo21/ Fas 阳性细胞凋亡,sApo21/ Fas 通过与Apo21/ FasL 竞争结合而抑制mApo21/ Fas 途径介导的细胞凋亡,因此可以认为sApo21/
11、 Fas 与肿瘤细胞逃避免疫监视以及恶性肿瘤的演变有关13 。梁启廉等 14 研究发现58 例肝癌患者化疗后有效患者血清sApo21/ Fas 浓度明显低于化疗前。本实验应用G2Rh2 不同时间干预A549/ DDP 细胞后,细胞培养上清液sApo21/ Fas 含量均显著低于对照组,说明G2Rh2可通过Fas/ FasL 系统途径诱导肺腺癌细胞凋亡。综上所述, 人参单体Rh2 具有诱导人肺腺癌A549/ DDP 细胞凋亡的作用,其分子机制可能是上调p53 和Fas 及下调Bcl22 的表达、通过Fas/ FasL 系统途径诱导细胞凋亡。参参 考考 文文 献献1 Ota T , Maeda M
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