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1、1赛润赛润 ELISA classic 肺炎支原体肺炎支原体 IgG/IgM/IgA目录目录1.用途用途2.诊断意义诊断意义3.赛润赛润 ELISA classic-检测原理检测原理4.试剂盒组成试剂盒组成5.检测所需物质，检测所需物质，试剂盒未提供试剂盒未提供6.储存和稳定性储存和稳定性7.赛润赛润 ELISA classic 的检验步骤的检验步骤7.1 注意事项7.2 样品准备和储存7.3 试剂盒反应试剂的准备7.4 检测程序概要7.5 检测过程8.检测结果评估检测结果评估8.1 4PL 单点定量法8.2 检验有效性标准 8.3 计算赛润 ELISA classic 肺炎支原体 IgG/I
2、gM/IgA（定量）8.4 检测结果分析9. 性能特性性能特性9.1 重复性9.2 敏感性和特异性10.警告警告10.1 警告和安全措施10.2 废料处理11.参考文献参考文献2赛润赛润 ELISA classic 肺炎支原体肺炎支原体 IgG/IgM/IgA酶联免疫法测定人体抗体（IgG/IgM/IgA） - 只限用于体外诊断-IgG 试剂盒（定量）试剂盒（定量） 编号 ESR127G IgM 试剂盒（定量）试剂盒（定量） 编号 ESR127M IgA 试剂盒（定量）试剂盒（定量） 编号 ESR127A检测评估标准检测评估标准: BEP 2000, BEP III, DSX, 手动操作手动操
3、作1.用途用途赛润赛润 ELISA classic 肺炎支原体肺炎支原体 IgG/IgM/IgA 用于定性和/或定量检测人血清或 血浆内肺炎支原体。抗肺炎支原体病毒 IgG，IgM 和 IgA 联合使用会有助于对肺 炎支原体感染做出确切的诊断。IgA-Elisa 的使用特别在诊断再感染时，对于 IgG 和 IgM 诊断是一个重要的补充。2.诊断意义诊断意义支原体肺炎病毒的感染会导致许多有可能引起严重并发症的呼吸系统疾病。在这些 疾病中首先值得一提的是初级非典型肺炎，咽炎以及呼吸道支气管炎。在美国支原 体肺炎病毒的感染要占每年门诊肺炎的 20%。肺炎支原体感染的临床症状具备多样性并且与其它原因引
4、起的呼吸道感染（如呼 吸道合孢病毒，流感-感染等）很难区别。肺炎支原体可使气管、支气管以及细 支气管上皮细胞增生。感染后 10-20 天之后才出现一些非特异症状，如头疼、发 烧、无痰干咳等。在感染期限间还可能会发展成间质性肺炎。大龄儿童和小龄成 年人门诊肺炎的 15-20%来自肺炎支原体病毒。在儿童中观察到病毒性感染（如 麻疹）或细菌性感染（链球菌肺炎）后的肺炎支原体的重复感染。小龄儿童（5 岁）中肺炎支原体感染经常无症状而消失或只导致轻度呼吸道感 染。由于感染后没有足够的免疫力存在，会出现需要长时间康复期并不断加重的 再感染（多次）。正因为这些不同症状的存在，诊断不能仅靠临床现象进行，而 需
5、要进一步地确诊（如病原体证明，血清学等），以便进行相应的治疗。3肺炎支原体感染的病理学以支原体与呼吸道上皮细胞粘结，以在宿主细胞上滑动 和宿主高细胞免疫活性为基础。（细菌凝集素和人宿主细胞的同源性很有可能可 以预防凝集，降低细胞免疫活性进而组织上皮细增生）。肺炎支原体感染的免疫反应可以描述如下：IgM-抗体是在发生特殊症状后约 7 天之后可以被检测到。在首发症状后的 10-30 天后可以检测到最大的 IgM-抗体浓度。12-26 周后 IgM-抗体的滴定度将降低到 无法检测的程度。IgM-抗体最频繁地出现于初期感染阶段，因此，在较年轻患者中能测到高浓度的 IgM-抗体，而在大龄患者（很有可能再
6、感染了的）中几乎测不出或测到极微乎其 微的 IgM-抗体。正由于其常有的再感染，IgM-抗体会被削弱并降低到检测不到 的水平。在刚刚被感染的情况下，IgA-检测的结果清楚、敏感。大量的抗体形成于出现感 染症状的 3 周内，从出现感染症状第 5 周起 IgA 和 IgM 抗体浓度下降。IgA-抗 体浓度下降的速度比 IgM-抗体的浓度更快。肺炎支原体感染 IgG-抗体的出现要比 IgA-抗体和 IgM-抗体晚。它在发病第 5 周 后才达到最大浓度。因为 IgG-抗体反应是肺炎支原体感染最可靠，也是最晚期的 反应，所以仅有 IgG 检测通常被视作确诊的标志。急性感染很少会有无 IgA-抗体和 Ig
7、M-抗体产生的情况。在这种情况下，诊断应 更依赖于 IgG-抗体的检测。CFT 试验是应用最为广泛的诊断肺炎支原体-感染的血清学方法。它最致命的缺 点就是由于全细胞抗原制备中 LPS-分子交叉反应导致的低异性。显而易见地， 具有较高特异性的结果来源于使用特制抗原的 Elisa 方法（如 P1 肺炎支原体的 粘结）。3.赛润赛润 ELISA classic-检验原理检验原理用抗原抗原包被微量板孔，制成固相载体固相载体。加患者血清到板孔中，其所含的抗体特异 性地与固相载体中存在的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物质后，加入碱碱 性磷酸酶标记的性磷酸酶标记的 IgG、IgA 和和 IgM 抗体，使
8、之与上述免疫复合物反应。洗板，除 去多余的结合物，加入底物（对硝基苯磷酸盐）。该反应产生有颜色产物，颜色 强度与特异性抗体含量成正比。44.试剂盒的组成试剂盒的组成 试验成分试验成分IgG 试剂盒 IgM 试剂盒 IgA 试剂盒数量 / 剂量微孔条（此微孔条可掰开单独使用，每条有微孔条（此微孔条可掰开单独使用，每条有 8 孔，共孔，共 96 孔，已经包被了抗原）孔，已经包被了抗原） 1 个微孔条框架 包被的抗原为灭活抗原12 12 12标准血清（立即可用）标准血清（立即可用） 人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗 HIV 抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙 肝病毒（HCV）抗体均为阴性；
9、防腐剂：0.1% 叠氮化钠 染色剂：紫红色 O22 毫升 22 毫升 22 毫升阴性质控血清（立即可用）阴性质控血清（立即可用） 人血清溶于含蛋白的磷酸盐缓冲液；抗 HIV 抗体、抗乙肝病毒（HBV）表面抗原和抗丙 肝病毒（HCV）抗体均为阴性； 防腐剂：0.1%叠氮化钠 染色剂：里沙明绿 V12 毫升 12 毫升 12 毫升酶标记的抗人酶标记的抗人 IgG, IgA, IgM （立即可用）（立即可用） 羊抗人 IgG, IgA, IgM（多克隆），碱性磷酸 脂酶，以蛋白稳化溶液加以稳化。 防腐剂: 0.02%甲基异噻唑啉酮 0.02%溴化硝基二垩烷13 毫升 13 毫升 13 毫升浓缩洗液（
10、可稀释至浓缩洗液（可稀释至 1000 毫升）毫升） 氯化钠，含吐温 20 和 30mM Tris 防腐剂： 0.1%叠氮化钠133.3 毫升 133.3 毫升 133.3 毫升稀释缓冲液稀释缓冲液 磷酸盐缓冲液，内含蛋白和吐温 20 防腐剂： 0.1%叠氮化钠 0.01 克/升的溴酚蓝钠盐250 毫升 250 毫升 250 毫升终止液终止液 1.2N 氢氧化钠15 毫升 15 毫升 15 毫升底物（立即可用）底物（立即可用） 邻硝基苯磷酸盐，不含其它溶剂的缓冲液 防腐剂：浓度小于 0.1%的叠氮化钠 （瓶子未盖好底物可能会轻微变黄，但不会 影响其质量）13 毫升 13 毫升 13 毫升5带有标
11、准曲线和评估表的质量控制认证文件带有标准曲线和评估表的质量控制认证文件 （抗体以 IU/毫升或 U/毫升计量）1 1 15.其它检测所需物质其它检测所需物质- 普通实验室所需的仪器装置 - IgM 检测：赛润类风湿因子 Rf吸附剂（产品编号 Z100/5ml 和 Z200/20ml） - 分光光度计，波长 405 纳米，建议参考波长范围 620 纳米- 690 纳米（例如 650 纳米） - 37温箱 - 湿盒 - 蒸馏水。6.储存及稳定性储存及稳定性试剂试剂储存储存稳定性稳定性微孔条（抗原）开封后放在 2-8装有干 燥剂的密封铝箔袋中。有效期内质控血清 / 标准血清开封后保存于 2-8。有效
12、期内； 18 个月酶标记抗体立即可用的溶液于 2-8 储存。 避免污染（使用无菌针头） 。有效期内 24 个月稀释缓冲液 开启后于 2-8储存。 有絮状时丢掉未开封18 个月有效期内 36 个月洗涤液浓缩液开封后保存于 2- 8。 工作液在 2-8。 工作液在室温下。 盛过工作液的瓶子应按常 规方法清洗，并丢弃混浊 溶液。有效期内 2 星期 1 星期底物2-8储存，避光。 避免污染（使用无菌针头） 。当溶液变为黄色时应予有效期内 24 个月6以丢弃（水作空白，吸光 度大于 0.2 时）。终止液开封后保存于室温下。有效期内7.赛润赛润 ELISA classic 的检验步骤的检验步骤7.1 注意
13、事项注意事项只有全部使用赛润赛润 ELISA classic 试剂试剂才能保证检测效果，因为所有试剂都是有 关联的，不能混用其他制造商的产品。尤其是标准血清，对照血清以及酶标记物， 必须使用试剂盒配备的，不要使用其它批号产品。稀释缓冲液，洗液，终止液和 底物溶液可用于所有赛润 ELISA classic 试剂盒。ELISA classic 试剂盒内所有试剂均必须正确地存放。应在未开封的情况下，保存 于 2-8，并在有效期（见标签说明）内使用。详细的稳定性和储存资料在“6. 储存及稳定性”内将加以详述。每一种试剂都是经过校准以保证最佳的检测结果。这些试剂如果未经规定被稀释 或改动都会导致检测的敏
14、感度的降低。在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发 和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的 结果。应按照规定刻度截断微孔条。当装微孔条的铝袋开封后，应及时用夹子夹紧，否 则不可使用。开始试验前，将所有试剂置于室温。从试剂管中吸取试剂的时候，应注意使用无菌技术以防污染。为避免假阳性结果， 吸加酶结合物时，吸嘴应确保不接触或喷洒于小孔的外面，注意不要盖错瓶盖或 管盖。试验结果的可重复性依赖于充分混合试剂。使用前振荡装有对照血清的小管和所 有稀释过的溶液（例如使用混合器）。小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 /
15、 对照血 清，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，7将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。只有严格遵守赛润 ELISA classic 试剂的试验说明才会得到最佳的检测结果。如果实验中未严格遵守质量控制认证文件上的有效性特异准则，则试验结果无效。洗涤不充分将影响试验结果：应该小心进行洗涤。洗涤步骤应遵守相关洗涤器（平底孔，孔直径 7 毫米，深 10.9 毫米）指导手册进行。重要的是所有的孔内均应加入相同体积的洗涤缓冲液。 洗涤结束时，应将微孔板倒扣于纸巾上并轻轻敲打，以确保所有孔内均无洗涤缓 冲液。避免产生泡沫！如果使用自动洗板机
16、，注意正确操作。7.2 样本准备储存样本准备储存虽然，在检验中不会产生副影响，但为避免干扰结果，应保留使用高血脂的、溶 血的或污染的血清。样品不应加热灭活。样品不应加热灭活。7.2.1 样品稀释样品稀释开始试验前，患者的待测样品必须以稀释缓冲液稀释如下（V1+V2）：V1+V2=1+100 加 10 微升 患者待测样品于 1000 微升 稀释缓冲液稀释后及加入微孔板前，样品必须充分混合。类风湿因子干扰类风湿因子干扰类风湿因子抗体是 IgM 的自体抗体的自体抗体，可与 IgM 免疫复合物结合。非特异性 IgM 抗体（风湿因子）的存在将导致 IgM 检测的假阳性结果。另外，也存在弱结合 的病原体特异性 IgM 抗体被强结合的 IgG 抗体取代的可能性。在这种情况下， IgM 的检测将得到假阴性假阴性
