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1、【关键词关键词】 乳腺癌；基因治疗；肿瘤乳腺癌；基因治疗；肿瘤:乳腺癌是一种常见的妇科肿瘤，约占全身恶性肿瘤的 7%10%，近 20 年来在我国的发病率逐渐升高，已严重威胁女性健康，仅次于宫颈癌。针对早期（、期）乳腺癌的治疗方法有外科手术切除、放疗、内分泌治疗以及使用抗肿瘤药物进行治疗（如紫杉醇、维甲酸类等），但对晚期乳腺癌的治疗效果不佳。由于肿瘤是一种多基因参与的分子疾病，基因治疗乳腺癌应能取得较好的疗效。基因治疗的方法有体外和体内治疗，具体导入方法又分为病毒和非病毒载体介导，一般临床试验方案采用病毒作为载体。本文就乳腺癌基因治疗的策略作一综述。1 1 调节机体免疫系统调节机体免疫系统:通过
2、诱发针对肿瘤细胞相关抗原（TAA）特异性免疫反应的治疗，提高肿瘤细胞的免疫原性，激发机体抗肿瘤免疫。1.1 导入免疫原性相关分子参与肿瘤细胞免疫识别相关基因表达产物（如 HLA、B7 等）的降低可使肿瘤细胞的免疫原性降低。Pulaski 等1用转染编码 MHC和 B7.1 基因的肿瘤细胞作为肿瘤疫苗，治疗诱导 BALB/c 鼠产生的乳腺癌细胞 4T1，实验证明能有效抑制癌细胞的自发转移。Dissanayake 等2利用逆转录病毒将编码MHC 和 链及 CD80 基因转染到鼠 SaI 肉瘤、B16 黑色素瘤及 4T1 乳腺癌细胞作为肿瘤细胞疫苗，结果可以激活肿瘤特异性的 CD4+T 淋巴细胞。由
3、于这些癌细胞自身能表达 MHC，因此可以与 CD8+T 淋巴细胞协同作用，产生高效的特异性抗肿瘤免疫并保持长期的免疫记忆。1.2 导入免疫反应相关的细胞因子将某些细胞因子（如 IL2,IL4,IL12,IFN,TNF,GMCSF 等）的基因转染到机体免疫细胞（如 TIL,LAK 细胞及细胞毒淋巴细胞）中，可提高或诱导机体抗肿瘤免疫。Oshikawa 等3用基因枪将IL12，IL18 前体及 IL1 转化酶的 cDNA 重组表达载体注射到鼠乳腺癌模型，IL12 与 IL18 的联合作用加强了细胞毒 T 淋巴细胞（CTL）的毒性作用以及 NK 细胞的杀伤性，并能诱导 IFN 的产生，增强了抗肿瘤活
4、性，可完全抑制乳腺癌细胞 TS/A。MUC1 粘蛋白是一类高分子糖蛋白，在乳腺癌等多种肿瘤中过表达，且糖基化畸形和不完全可导致新的抗原肽表位暴露，成为肿瘤免疫治疗的靶分子。有报道用MUC1 单链抗体和 IL2 融和蛋白（C595scFvFcIL2）治疗 MUC1 阳性的 MCF7 乳腺癌细胞，可刺激增殖活化的淋巴细胞并活化 NK 细胞，杀死癌细胞4。国内也有报道使用细胞因子 GMCSF 能加强 muc1基因疫苗诱导小鼠产生的特异性 CTLs 及体液免疫应答，抑制小鼠乳腺癌细胞 EMT6 的生长5。1.3 激发针对不同肿瘤相关抗原的免疫反应树突状细胞（DC）是专职抗原递呈细胞，可诱导出高效而特异
5、的抗肿瘤免疫。将肿瘤抗原转染入 DC 产生特异性免疫反应是这一领域研究的重点。有报道将乳腺癌细胞与 DC 融合形成肿瘤疫苗激活机体免疫反应，可促进抗癌效应6。还有研究发现 DC 捕获凋亡的乳腺癌细胞可诱导肿瘤特异性的 T 淋巴细胞分化，产生大量 CTLs 杀死乳腺癌细胞。这是一种新的免疫基因治疗乳腺癌的方法，可识别乳腺癌共有的抗原7。还有一些在乳腺癌突变率较高的癌基因和抑癌基因（如 HER2/neu,BRCA1/2,p53 等），它们的蛋白结构的变异也可形成肿瘤细胞特有的抗原决定族，这些突变的基因也可用来制成 DNA 疫苗；但肿瘤患者自身的系统性免疫耐受能否被一两个抗原所打破还需进一步的实验研
6、究。2 2 肿瘤细胞与正常细胞差异表达的基因肿瘤细胞与正常细胞差异表达的基因2.1 抑制癌基因的治疗原癌基因是人体细胞固有的基因，其表达产物在正常状态下为细胞增殖分化所必需，在特定条件下，原癌基因被激活诱导细胞恶性转化或恶变。抑制癌基因的功能可以达到治疗肿瘤的目的。与乳腺癌发生有关的癌基因主要有 HER2,ras,cmyc 等8，有 20%的原发性乳腺癌与人表皮生长因子受体（HER2又称 HER2/neu,erbB2）有关，其定位于 17q24，编码具有酪氨酸活性的跨膜蛋白，控制细胞增殖、血管生成以及细胞能动性、转移和抗凋亡的信号传导，基因扩增和过表达为主要突变形式9。Hortobagyi 等
7、10完成了用阳离子脂质体介导具有抗肿瘤活性的 5 型腺病毒基因 E1A 和 HER2 启动子，腔内注射治疗人乳腺癌和卵巢癌细胞的期临床研究，结果表明，E1A 在两种细胞都有表达并伴有HER2/neu 的下调表达，促进凋亡，抑制增殖，为进一步期临床试验提供了有力证据。针对 erbB2过表达的人乳腺癌细胞，也可使用 RNA 干扰技术（RNAi）沉默其表达，使癌细胞周期停滞在 G0/G1 期，有效抑制癌细胞增殖，诱导凋亡11。此外，一种人源重组单克隆抗体 Herceptin（荷赛停）能与 HER2蛋白的胞膜外肽段结合，从而抑制信号传递过程，该药于 1998 年被美国 FDA 正式批准用于乳腺癌的临床
8、治疗。有 15%25%的乳腺肿瘤出现 cmyc 扩增和过表达，并导致预后不良或癌细胞具有侵袭性的临床特性。Jamerson 等12研究发现，凋亡蛋白 Bax 的表达有助于乳腺肿瘤中 cmyc 引发的凋亡作用，这一发现为基因治疗乳腺癌提供了新的靶作用位点。也可利用 RNAi 封闭 cmyc 的表达，降低乳腺癌细胞株MCF7 中 cMyc 蛋白的表达水平，体内体外试验都成功地抑制癌细胞生长13。有研究证实,约 30%恶性肿瘤中可见 ras 癌基因的激活性突变,而 ras 信号通路组成性激活对于细胞的恶性转化是必需的,所以ras 可作为肿瘤治疗的重要靶点14。Ahn 等15将内源性基质金属蛋白酶2
9、抑制因子（TIMP2）通过逆转录病毒载体导入乳腺上皮细胞株 MCF10A，TIMP2 在胞内的高表达可有效抑制 Hras 诱导的侵袭和转移。2.2 抑癌基因的治疗抑癌基因治疗是通过基因转移法恢复或增加肿瘤细胞中失活或缺失的抑癌基因并恢复其功能，从而对肿瘤产生治疗作用并抑制其转移。在众多目前已发现的抑癌基因中，估计高达一半的人类肿瘤都存在 p53基因的突变，在乳腺癌中大约有 20%30%。 Prabha 等16利用非病毒载体纳米粒介导野生型 p53DNA原位重复注射治疗乳腺癌，能持续且显著地抑制癌细胞增殖，实验还证明此种可融合的多聚物（PLGA）载体比现在通用的阳离子脂质体的转染效率更高。在家族
10、性乳腺癌和卵巢癌中发现与其发病相关的抑癌基因BRCA1 常存在突变，大约 0.12%的普通人群也存在 BRCA1 的突变，40 岁以下的妇女有 5%的乳腺癌患者存在突变，说明 BRCA1 是乳腺癌的一个易感基因17，矫正 BRCA1 基因，恢复其正常功能是治疗家族性乳腺癌的主要策略。体内体外试验都证明能有效抑制癌细胞的生长，但具体的作用机制还不明确，可能与WAF1/CIP1、p53、Rb 之间相互作用有关18。与乳腺癌发生相关的抑癌基因还有 p27，FHIT，PTEN 等，相关研究也有报道1921。2.3 凋亡基因的治疗肿瘤细胞的无限制增殖与细胞正常凋亡途径调节失控有关。经过对大量凋亡介质的研
11、究发现，一部分因子与乳腺癌发生密切相关，如细胞生长因子和表皮生长因子受体，类胰岛素生长因子的过度表达；调节凋亡信息传导通路的促凋亡、抗凋亡因子：p53，Bcl2，Bax，肿瘤坏死因子（TNF）等的异常表达。大部分肿瘤的发生与抗凋亡蛋白 Bcl2 表达水平增高有关，Holle 等22构建了 T7 启动子的载体系统（Bcl2/T7），利用 RNAi 技术对人乳腺癌细胞株 MCF7 的 Bcl2 的 mRNA 靶向抑制，有效地降低Bcl2 蛋白的表达水平，抑制细胞增殖。另有报道用溶瘤腺病毒介导肿瘤坏死因子诱导凋亡配体（TRAIL）基因联合治疗鼠乳腺癌模型，诱导细胞凋亡，为进一步前期临床研究提供了有力
12、证据23。2.4 化学基因的治疗骨髓抑制是乳腺癌化疗失败的重要因素之一，乳腺癌患者在进行大剂量根治性化疗以杀灭体内肿瘤细胞时，常由于造血干细胞不能耐受而死于造血衰竭。多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药同时也对其他结构和作用机制不同的药物获得耐药性。目前已分离了两种多药耐药基因：MDR1、MDR3，其中 MDR1 与肿瘤细胞典型多药耐药有关,若将 MDR1 基因导入骨髓造血干细胞使之获得多药耐药表型，就能增加肿瘤患者对化疗药物的耐受性，为临床大剂量化疗以及多次重复化疗提供了可能。Takahashi 等24在乳腺癌的 MDR1 基因治疗临床研究中发现,对进展期乳腺癌和复发性乳腺
13、癌患者进行大剂量化疗的同时移植已转入 MDR1 基因的自体同源外周干细胞(PBSCT), 体内均观察到 MDR1 转基因造血干细胞的浓集，能明显抑制肿瘤生长，改善预后且无其他明显的不良反应。此外，多药耐药性的癌细胞还可促进 E1 缺陷的腺病毒（如 Ad312 和 Ad520）的复制，由此可找到新的溶瘤病毒来治疗 MDR 相关的恶性疾病25。目前研究的耐药基因还包括二氢叶酸脱氢酶（DHFR）基因及 O6 甲基鸟嘌呤DNA 甲基转移酶(MGMT)基因等。2.5 抗血管生成的治疗血管生成在肿瘤的生长过程起重要作用，早期肿瘤细胞生长靠邻近组织器官微环境渗透供养，当肿瘤直径达到或超过 12 mm 时，必
14、须有新生血管的形成，肿瘤才能持续生长。肿瘤血管的形成受多种因子调节，利用各种基因治疗载体将抗血管生成因子包括内皮抑素、血管抑素和 IFN 等运送到体内，可抑制肿瘤生长。Gyorffy 等26使用腺病毒载体介导鼠源血管生成抑素剂 Angiostatin 和 IL12，瘤内注射鼠乳腺癌模型，实验结果表明 AdAngio 显著抑制了肿瘤的生长，65%的肿瘤退化；AdIL12 引起 20%肿瘤退化,13%肿瘤完全消失；二者联合注射使 96%的肿瘤退化,54%完全消失,并且动物对再次接种肿瘤细胞的免疫力得到提高。目前研究较多的是血管内皮生长因子（VEGF），如利用 VEGF 单克隆抗体阻断 VEGF 与
15、受体结合,或将 VEGF 受体单抗与其他细胞因子共表达联合治疗27，或利用反义核酸技术抑制 VEGF 表达从而抑制肿瘤血管的形成。2.6 自杀基因的治疗自杀基因又称为前体药物酶转化基因，可将无毒的前体药物代谢为细胞毒性药物，从而使导入自杀基因的细胞死亡。这类基因包括单纯疱疹病毒胸苷激酶基因丙氧鸟苷(HSVtkGSV)和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因5氟胞嘧啶（ECCD5Fc）、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因(VZVtK)、黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)基因等，目前研究比较深入且与肿瘤基因治疗关系最密切的是 TK 基因和CD 基因。Gadal 等28使用 HSVtk 转染 MCF7 和 MC
16、F7ras 细胞，再加入 GCV（二羟丙氧甲基鸟苷）联合治疗无胸腺小鼠乳腺癌模型，结果显示 HSVtk/GCV 在疗后的 60d 仍可显著抑制肿瘤的发展，其中一些小鼠治疗后得到根治，未出现肿瘤复发。实验还表明 HSVtk/GCV 在体内疗效更好，这可能与旁观者效应有关。Pandha 等29对 12 例乳腺癌患者进行了自杀基因疗法的期临床试验，将含有 erbB2 启动子的 CD 基因和前体药物 5Fc 的 pERCY 质粒，原位注射到肿瘤部位,使 CD 基因在 erbB2 阳性乳腺癌细胞中高表达,加入相应的前体药物后,显著抑制了肿瘤生长。该方法安全，无明显毒副作用，提供了一个靶向驱动自杀基因转录的治疗模式。这是第 1 例利用 CD/5Fc 自杀基因体系进行人体乳腺
