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1、1组织对氧磷酶组织对氧磷酶 1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书 （中文版）（中文版）主要用途主要用途组织对氧磷酶 1（PON1）有机磷酸酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过对氧磷酶 1 反应系统中，水解有机磷酸，释放出对硝基苯产物，出现吸光峰值的变化，即采用光度法来测定组织样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体组织裂解悬液样品对氧磷酶 1 的有机磷酸酶活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。技术背景技术背景对氧磷酶（parapxonase；PON；EC3
2、.1.8.1）是一种水解酯类（esters） 、有机磷酸酯（organophosphate）和内酯（lactone）的多态性酶，分成三个亚型：PON1、PON2、PON3。结构同源性在基因层面上达70%，在氨基酸层面上达65%。其中PON1，为钙离子依赖性和高密度脂蛋白（high density lipoprotein；HDL）相关性糖蛋白，含有354氨基酸，43Kd分子量，分布在肝脏、肾脏、小肠和血清（50毫克/升）中。具有有机磷酸酶（organophosphtase） 、磷酸三酯酶（phosphotriesterase） 、芳香酯酶（arylesterase）和硫内酯酶（thiolacto
3、nase）等多重活性：PON1与HDL结合，水解各种LDL和HDL上的氧化性磷酯，以及芳香族羧酸酯、芳香族和脂肪族内酯等，例如杀虫剂对硫磷（parathion）降解产物对氧磷（paraoxon） 、毒死蜱（chlorpyriphos） 、神经毒因子沙林（sarin）和索曼（soman） 、同型半胱氨酸（homocysteine）硫内酯、二氢香豆素（dihydrocourmarin；DHC） 、-丁内酯（-butyrolactone）等，延缓和抑制低密度脂蛋白（low density lipoprotein；LDL）氧化作用，阻止脂质过氧化物产生，保护脂蛋白以及质膜受到氧化损伤，达到抗粥样硬化（
4、antiatherogenic） 、解毒、抗氧化的功能。PON1活性降低与慢性肾衰、糖尿病、外周神经病变、家属性高胆固醇血症、心血管疾病、肝纤维化等有关。PON2为44Kd分子量，分布在脑、肝脏、肺、肾脏、睾丸等大多数组织中，但血清中测不到。PON2具有水解芳香酯和内酯酶的功能，但不能水解有机磷酸。具有细胞内抗氧化作用，预防粥样硬化等功能。PON3为40Kd分子量，主要分布在肝脏中，少量在肾脏中。主要水解各种内酯和环状羧酸酯，具有抗氧化功能。基于人工合成底物对硝基苯磷酸二乙酯（diethyl-p-nitrophenylphosphate） ，在对氧磷酶1的作用下，水解产生对硝基苯（p-nitr
5、ophenol）和磷酸二乙酯（diethyl phosphate），通过对硝基苯产物吸收峰值的变化（405nm波长），来定量分析对氧磷酶1的有机磷酸酶活性。其反应系统为：产品内容产品内容清理液（Reagent A） 毫升裂解液（Reagent B） 毫升缓冲液（Reagent C） 毫升底物液（Reagent D） 毫升阴性液（Reagent E） 毫升产品说明书 1 份2保存方式保存方式保存 底物液（Reagent D）在20冰箱里；其余的保存在 4冰箱里； 底物液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全；有效保证 6 月用户自备用户自备1.5 毫升离心管：用于样品 CAOZUO1 的容
6、器15 毫升锥形离心管：用于样品操作的容器（微型）台式离心机：用于样品制备比色皿或 96 孔板：用于光度测定的容器分光光度仪或酶标仪：用于光度分析实验步骤实验步骤一、一、样品准备样品准备1 手术取出动物组织，并秤重以确定 500 毫克组织重量 2 （选择步骤）放进预冷的 15 毫升锥形离心管3 （选择步骤）加入 xx 毫升 清理液（清理液（Reagent A）清洗 1 次4 移入到一个液氮冻存管5 即刻放进液氮罐过夜6 次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）7 放进一个 15 毫升锥形离心管8 加入预冷的 xx 微升 裂解液（裂解液（Reagent
7、 B） 9 转移到预冷的 1.5 毫升离心管10强力涡旋震荡 30 秒，充分混匀11置于冰槽里孵育 30 分钟，期间每 10 分钟强力涡旋震荡 30 秒（注意：如需暂时停止，放进70冰箱里储存备用）12放进 4微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM，例如 eppendorf 5415）13小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管14移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）15即刻放进70保存或置于冰槽里继续后续操作二、二、测定准备测定准备1.开启并设定好分光光度仪（温度为
8、37）：波长 405nm，间隔 1 分钟，读数 6 次（共 5 分钟） ，并置零 2.从20冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化 3. 缓冲液（缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度三、三、背景对照测定背景对照测定31 移取 xx 微升 缓冲液（缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入 xx 微升 底物液（底物液（Reagent D）3 上下倾倒数次，混匀4 在 37温度下孵育 3 分钟5 加入 xx 微升 阴性液（阴性液（Reagent E）6 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7 即刻放进分光光度仪检测，此为样品背景对照（5 分钟读数0 分钟读数）四、四、样品测定样品测定1 移
9、取 xx 微升 缓冲液（缓冲液（Reagent C）到新的比色皿2 加入 xx 微升 底物液（底物液（Reagent D）3 上下倾倒数次，混匀4 在 37温度下孵育 3 分钟5 加入 50 微升待测样品（100 微克蛋白）6 上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）7 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（5 分钟读数0 分钟读数） 五、计算样品活性五、计算样品活性六、六、 酶标仪测定酶标仪测定1 在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和待测样品2 分别移取 xx 微升 缓冲液（缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里3 分别加入 xx 微升 底物液（底物液（Reagent D）到所有孔
10、里4 轻轻摇动 96 孔板5 在 37温度下孵育 3 分钟6 分别加入 xx 微升 阴性液（阴性液（Reagent E）或待测样品（20 微克蛋白）到相应孔里 7 轻轻摇动 96 孔板8 即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数注意事项注意事项1 本产品为 20 次（比色皿）和 80 次（96 孔板）操作 2 操作时，须戴手套3 底物液（底物液（Reagent D）具有毒性，注意操作安全4 系统测试过程中，背景测定仅需 1 次5 加样后 3 秒内光度测定6 测定值由低到高变化；测定可持续 5 分钟7 光度测定后，比色皿须清洗彻底8 样本测定 5 分钟读数高于 0 分钟读数表明具有酶活性9 建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/50 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒4GMS30030.1） 10如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度11对氧磷酶 1 有机磷酸酶活性单位活性定义为：在 37，pH 8.0 条件下，每分钟内能够生成 1 微摩尔对硝基苯所需的酶量作为一个活性单位12本公司提供系列对氧磷酶检测试剂产品质量标准质量标准1 本产品经鉴定性能稳定2 本产品经鉴定检测敏感
