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1、丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂 注册技术审查指导原则一、前言本指导原则旨在指导注册申请人对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)定量检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。本指导原则是对丙型肝炎病毒核糖核酸定量检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则未包含的研究内容，可自行补充。本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件
2、，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。二、适用范围丙型肝炎是一种主要经血液传播的疾病，丙型肝炎病毒慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。( (一一)HCV)HCV 特点特点 HCV 属于黄病毒科(flav
3、iviridae)，其基因组为单股正链 RNA，易变异，目前可分为 6 个基因型及 50 多种不同亚型，按照国际通行的方法，以阿拉伯数字表示 HCV 基因型，以小写的英文字母表示基因亚型(如 1a、2b、3c 等)。基因 1 型呈全球性分布，占所有HCV 感染的 70以上。HCV 基因组含有一个开放读框(open reading frame,ORF)，编码 10 余种结构和非结构(NS)蛋白，NS3 蛋白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B 蛋白是 RNA 依赖的 RNA 聚合酶，为 HCV 复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位，其末端具有核苷酸转
4、移酶活性，但由于RNA 酶缺乏矫正功能不能修正错配，多次复制后易导致 HCV 多种变异产生。( (二二) )丙型肝炎感染分布丙型肝炎感染分布 丙型肝炎呈全球性流行，是欧美及日本等国家终末期肝病的最主要原因。据世 界卫生组织统计，全球 HCV 的感染率约为 3%，估计约 1.7 亿人感染 HCV，每年新发丙 型肝炎病例约 3.5 万例。HCV 1b 和 2a 基因型在我国较为常见，其中以 1b 型为主；某些地区有 1a、 2b 和 3b 型报道；6 型主要见于香港和澳门地区，在南方边境省份也可见此基因型。（三）（三）HCVHCV RNARNA 定量检测定量检测HCV RNA 定量检测方法包括实时
5、荧光逆转录聚合酶链反应(qRT-polymerase chain reaction，qRT-PCR)、分枝 DNA(bDNA)等。本指导原则所指的 HCV RNA 定量检测试剂是指利用 qRT-PCR 方法的核酸检测技术，以 HCV 基因序列为检测靶标，对人血清、血浆及其他人体样本中的 HCV RNA 进行体外定量检测的试剂，可作为HCV 现症感染的证据和抗病毒疗效评估的观察指标。其他类同用途的核酸定量检测方法可参照本指导原则，但应根据产品特性确定其中具体内容是否适用，如不适用，应另行选择符合自身方法学特性的技术要求或评价方法。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可事项变更的产品。本指导原
6、则不适用于按照药品管理的用于血源筛查用途的 HCV RNA 检测试剂。三、基本要求（一）综述资料（一）综述资料综述资料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性的说明、研究结果的总结评价以及同类产品上市情况介绍等内容，其中同类产品上市情况介绍部分应着重从方法学及检出限等方面写明拟申报产品与目前市场上已获批准的同类产品之间的主要区别。应符合体外诊断试剂注册管理办法 （总局令第 4 号）和体外诊断试剂注册申报资料要求及说明 （国家食品药品监督管理总局公告2014 年第 44 号）的相关要求。（二）主要原材料的研究资料（二）主要原材料的研究资料应提供主要原材料如引物、探针、酶、标准品或企业参考品
7、等的选择与来源、制备过程、质量分析和质控标准等的相关研究资料。如主要原材料为企业自己生产，其生产工艺应稳定；如主要原材料源于外购，应提供的资料包括：选择该原材料的依据及对比试验资料、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。研究资料如下：1.企业内部参考品:应详细说明有关企业内部参考品的原料选择、制备、定值过程等试验资料。建议优先选择不同型别的临床阳性样本制备内部参考品以直接反映临床实际情况并起到质控的作用；企业也可选择假病毒（如，蛋白包裹 RNA，armored RNA）作为内部参考品，假病毒的优点是易制备、型别全且无生物安全性风险，但不像临床样本可以完整反应实际
8、的检测效能。建议企业内部参考品应覆盖 1-6 型，至少包括 1b、2a 型别的临床样本，各型别参考品在同一浓度水平应有多份样本。阳性参考品：应能至少覆盖常见亚型 1b、2a，每个亚型设置三个梯度并尽量覆盖线性范围，其中需包括至少一份弱阳性参考品接近检测下限（可高于检测下限一个数量级）。阳性参考品的亚型以及浓度需经过可靠方法进行确认。阴性参考品：可采用经确认无 HCV 感染的临床样本。检测限参考品：检测限参考品的原料要求参考阳性参考品。在进行最低检测限性能评估时，应设置多个梯度，从扩增反应终体系核酸浓度进行评价，建议采用 95%（n20）的阳性检出率作为最低检测限确定的标准。当设置检测限参考品时
9、，可以仅设置一个浓度水平，该水平可略高于 95%的阳性检出率水平，而设置为 100%检出，应明确参考品中靶核酸浓度水平。精密度参考品：精密度参考品原料要求参考阳性参考品，需至少包括对 6 个型别弱阳性、中或强阳性水平的精密度验证；如有必要，建议同时设置阴性参考品对精密度进行验证。2.试剂盒内对照品（质控品）试剂盒的质控体系通过设置各种试剂盒对照品来实现，质控体系需考虑对样本核酸分离/纯化、配液及加样、试剂及仪器性能、扩增反应抑制物（管内抑制）、交叉污染、靶核酸降解等因素可能造成的假阴性或假阳性结果进行合理的质量控制。对照品可采用质粒、假病毒或临床样本的核酸提取液等进行配置。申报资料应对试剂盒对
10、照品有关原料选择、制备、定值过程等试验资料详细说明。HCV RNA 定量检测试剂的质控品应至少设置三个量级水平的系列质控品:弱阳性质控品、强阳性质控品和阴性质控品。校准品和质控品均应参与样本核酸的平行提取，以对整个 PCR 反应过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制。企业应对各种质控品的 Ct 做出明确的范围要求。试剂盒质控体系主要考虑以下几方面：阳性对照品（质控品）建议对每个样品反应管设置强阳性对照品（质控品）及弱阳性对照品，阳性对照品应参与样本核酸的平行提取（如有必要），以对样本核酸分离/纯化、试剂及仪器性能、扩增反应过程等环节进行质量控制，企业应对各种阳性对照品（质控品）的 C
11、t 值做出明确的范围要求。如，可采用阴性人血浆+假病毒制备，应使用权威方法确认阴性人血浆的生物安全性及无干扰性：抗-HCV、抗-HIV 1/2、HBsAg 等检测阴性，HCV RNA 等检测阴性。阴性对照（质控品）：可采用阴性人血浆，应使用权威方法确认阴性人血浆的生物安全性及无干扰性，以对可能存在的交叉污染进行假阳性结果的质控。阴性对照品应参与样本核酸的平行提取。3.3.校准品：基质应采用血浆或血清，并能溯源至国家/国际标准物质，单位应使用 IU/ml 表示。提交完整溯源性文件，可参照 GB/T 21415-2008 体外诊断医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性 。
12、企业内部参考品、二级参考品、用于制备商品化校准品的储备液以及不同基因型的阳性样本均应能够溯源至国家参考品/国际参考品。使用国家参考品/国际参考品为校准品，应用多台仪器对企业一级参考品进行校准，以下逐级对企业二级参考品、校准储备液、阳性参考品进行校准。4.核酸分离/纯化组分（如有）的主要组成、原理介绍及相关的验证资料。5.聚合酶链反应（PCR）组分的主要材料（包括引物、探针、内标、各种酶及其他主要原料）的选择、制备、质量标准及实验研究资料，主要包括以下内容：（1） 脱氧三磷酸核苷（dNTP）核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，对纯度、浓度、保存稳定性等的详细验
13、证资料。（2）引物由一定数量的 dNTP 构成的特定序列，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，并包括对序列准确性、纯度、稳定性、功能性实验等方面的验证。如为外购，应提供合成机构出具的包括如上性能的质检证明，如聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）结果或高效液相色谱法（HPLC）分析图谱。（3） 探针特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段） ，能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。合成后经 PAEG 或其他适宜方法纯化，在 5-端标记荧光素报告基团或其他发光标记物，在 3-端标记荧光素淬灭基团，并经 HPLC 或其他适宜方法纯化,纯度应达到高效液相色谱纯。如为外
14、购，应提供合成机构出具的合成产物的质检证明(HPLC 分析图谱)；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作 HPLC 分析。（4）RT-PCR 反应所需酶通常包括以下几种活性：DNA 聚合酶活性: 以 RNA 为模板，催化 dNTP 聚合成 DNA 的过程。核糖核酸酶 H（RNase H）活性；由反转录酶催化合成的 cDNA 与模板 RNA 形成的杂交分子，将由 RNase H 从 RNA 5端水解掉 RNA 分子。DNA 指导的 DNA聚合酶活性；以反转录合成的第一条 DNA 单链为模板，以 dNTP为底物，再合成第二条 DNA 分子。热稳定性。为了去除过程中产物污染，建议
15、试剂盒组成体系增加尿嘧啶糖基化酶（UNG） ，该酶应具有尿嘧啶糖基化活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。应对酶活性有合理验证，应提供有关保存稳定性、活性及功能性实验等的研究资料。4.内对照（内标） 、校准品及质控品的原料选择、制备、定值过程及试验资料。申请人应对内标的引物、探针和模板的浓度做精确验证， 内标设置应合理，内标值应在一定范围内设定上下限范围且Ct 值不受靶序列的影响；通常选择假病毒,因不能反映提取问题，内标不应使用裸露 RNA。5.核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无脱氧核糖核酸酶（Dnase）和核糖核酸酶（Rnase）污染。（三）主要工艺及反应体系的研究资料（三）主要工艺及反应体系
16、的研究资料基本生产工艺主要包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对 pH、电导率等关键参数进行有效控制。生产工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、稳定性和有效期提供确切的依据，主要包括以下内容：1.主要生产工艺介绍，应用流程图方式表示，并标明关键工艺质控步骤。2.反应原理介绍。3.基因位点选择、PCR 方法学特性介绍。4.确定最佳 PCR 反应体系的研究资料，包括酶浓度、引物/探针浓度、dNTP 浓度、阳离子浓度、样本量、加样量及反应体积等。样本量应不少于 200 微升，提取纯化后尽可能将全部储备液加入反应体系中，加样量和反应体积参考相应行业标准，经研究验证后确定。5.确定 PCR 各阶段温度、时间及循环数的研究资料。6.对于基线阈值（threshold）和阈值循环数（Ct）确定的研究资料。7.不同适用机型的反应条件的对比分析，如果有差异应分别详述，并提供验证资料证明差异性对试验结果的影响。（四）分析性能评估资
