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1、 AFLP 实验操作指南 一、实验操作流程 1 提取 DNA 样本 2 DNA 酶切、连接同时进行 （1）反应体系（50ul）成 分体 积（ul）双蒸水35.8 10*Tango buffer5 EcoRI(10u/ul)0.5Mse(10u/ul)0.5 Ea （5pmol/ul）1 Ma （50pmol/ul）1 10mM ATP1 T4DNA 连接酶（5U/ul）0.2 模板 DNA（100ng/ul）5总体积50（2）反映程序37反应 35 个小时，最后保存于 4。 （3）检测取 46ul 酶切液进行酶切效果检测，跑出的带以弥散状、无明显主带为好。 （4）稀释 按 1：10 的比例稀释
2、，已稀释的和未稀释的均可长时间储存于-20oC 备用。3 预扩增 （1）反应体系成 分体 积（ul）双蒸水4.4 Premix taq10 EA00(100ng/ul)0.3 MC00(100ng/ul)0.3 稀释后已连接 DNA 模板5总体积20（2）反映程序a、94 2minb、94 30s、56 30s、72 1min 共 24 个循环c、72 5mind、保存于 4 （3）检测 取未稀释的预扩增液 46ul 进行琼脂糖电泳检测。（4） 稀释取部分预扩增后溶液按 1：25 的比例稀释。将已稀释的和未稀释的保存于20储 存。4.选择扩增（4）反应体系成 分体 积（ul）双蒸水4 Prem
3、ix taq10 EA-(100ng/ul) *0.5 MC-(100ng/ul) *0.5 稀释后已连接 DNA 模板5总体积20*:EA-,MC后面两个碱基因不同引物对而不同。迅速漩涡混匀 10s，或者离心 4000r/min，10s。 （2） 反应程序 a、94 4min b、第 113 个循环：94 30s, 65 30s, 72 1min（退火温度每隔一个循环 降低 0.7） ； c、第 1436 个循环：94 30s, 56 30s, 72 1min； d、72 5min, 4保存。 6变性 （1） 变性剂（Loading buffer）配方组 分体 积98%去离子甲酰胺49ml
4、EDTA(0.5M PH=8.0)1ml 二甲苯青 FF(Xylene Cyanole FF)0.125g 溴酚蓝（Bromphenol Blue）0.125g（2）变性：将 7ul 变性剂加入 14ulPCR 反应产物，95变性 5min，并迅速置于冰上。 7. 制胶溶液 （1） 一块胶的配方（60ml） 将 12ml 5XTBE 和 25.2g 尿素（Urea）混合加水定容至 51ml，向其中加入 9ml 40的丙烯 酰胺溶液，240ul 10%过硫酸胺（APS）和 60ul 四甲基乙二胺（TEMED） 。 （2） 各组分配方 5X TBE：54g Tris 碱( Tris-base）,2
5、7.5g 硼酸( B-acid）和 3.72gEDTA(或 0.5M,PH=8.0，EDTA 20ml)混合定容至 1L。 40丙烯酰胺溶液：2g 甲叉双丙烯酰胺（N、N-Methylene Bisacrylamide）,38g 丙烯酰胺 （Acrylamide）混合加水定容至 100ml，4棕色瓶可保存 2 个月。 10过硫酸胺溶液：1g 过硫酸胺（APS）加 ddH2O 定容至 10ml。 8. 亲水和疏水处理及灌胶 （1） 长玻璃（亲水玻璃）处理： a、亲水剂制备：3ml 无水乙醇，10ul 亲水硅烷,10ul 冰醋酸混合。此为一块板用量。 b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。 c
6、、用手巾纸浸亲水剂涂搽玻璃板。 d、干燥 20 分钟，用约 2ml 95的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向再 涂搽一遍。e、晾干约十分钟。 （2） 短玻璃（疏水玻璃）处理a、换手套，以防亲水剂和疏水剂交叉污染。如果出现污染情况，可将玻璃浸入 10的NaOH 溶液中。b、洗净玻璃板，以水沿玻璃板均匀下流为好。c、用纸巾浸 750ul 剥离硅胶分两次涂搽玻璃板，要均匀。d、干燥 20 分钟，用约 2ml 95的酒精再轻轻涂搽玻璃板（以均一方向）然后在垂直向 再涂搽一遍。e、晾干约十分钟。f、疏水处理做一次大约可以跑 5 块胶再做或当出现轻微扯胶情况时再做。 （3） 将长玻璃放在水平泡
7、沫垫上，亲水面向上，将两个胶条平行分置于其较长的两边， 然后轻轻放上疏水玻璃，疏水面向下。这样在两玻璃间形成了一个矩形空隙。用夹子夹住 固定。 （4） 用胶带将左右两边和底边封上，留出插梳子的边（有凹边的那一边） ，封时要均匀不 留气泡。 （5） 将梳子插入有凹边的缝隙，看是否容易均匀，不行要适当调整。 （6） 将有凹边的那边稍稍垫高，然后配胶用注射器筒灌入，要从一边均匀灌入，胶中不 留气泡。 （7） 将梳子平直边插入凹口缝隙，以形成一个胶的平直端。注意其端线应与玻璃板的长 边垂直。 （8） 让胶至少聚合两个小时。9. 电泳 （1） 将电泳槽底盒装入 400ml 1X TBE 缓冲液，上盒装入
8、 500ml 1X TBE 缓冲液。 （2） 轻轻拔掉梳子，固定玻璃于电泳仪上，到入上盒缓冲液，用 1000ul 枪冲洗凹口缝隙， 冲干净为好，65W 预电泳 30min。 （3） 预电泳完毕断开电源，再次冲洗缝隙，然后将梳子齿端插入凹口缝隙，其齿尖端轻 轻的插进胶中，以构成点样孔。 （4） 点入 35ul 变性后的样品。 （5） 65W 电泳约 90min，直到溴酚蓝到离顶端 1/2 为好。 （或二甲苯青刚到底部） （6） 电泳完毕，分开两玻璃板，将固着胶的亲水板放入预先准备好的 10的醋酸固定液 中浸泡固定脱色。10. 银染 （1）试剂的配制 1.固定/终止溶液（10%的冰醋酸）：将 20
9、0ml 冰醋酸加入到 1800mlddH2O 中，现用现配， 不能反复使用。20min 2.染色液：2L 超纯水中加入 2g 硝酸银。 3.反应液：2L 超纯水中加入 30gNaOH、10ml 甲醛，冰浴中冷却至 10。 （2）染色步骤 1.将长、短玻璃板分开：电泳结束后，用一个塑料棒小心地将长短板分开，聚丙烯酰胺应 粘附在短玻璃板上。 2.固定胶：将粘着聚丙烯酰胺凝胶的短玻璃板放入塑料浅盘中，加入固定终止液，使粘着 胶的玻璃板浸泡在固定/终止液中。将胶在摇床上摇动 20min 或至电泳示踪染料消失。胶可 在固定/终止液中过夜，收集固定终止液，以备下面步骤 8 中终止染色反应用。若此时反应 液
10、尚未冷却，可放入冰浴中致冷。 3.洗胶：在摇床上用超纯水洗胶 3 次，每次 2min，或 3min，2 次。每次洗完后将粘着胶的 玻璃板取出沥干 1020s 再进行下一次洗涤。 4.染色：将粘着胶的玻璃板移至染色液中，在摇床上摇动 30min。将胶从染色液中取出，放在一边。染色液回放到烧杯中，塑料盘清洗后加入超纯水。这段时间不要超过 510s。 漂洗时间过长会导致信号变弱。 5.洗胶：将胶浸入超纯水中，取出沥水，立即放入盛有预冷反应液的塑料盘中。胶从超纯 水中取出到放入反应液的时间不能超过 510s。 6.显色反应：胶在摇床上摇动至出现模板带或可见一条带。将胶转至剩余的 1L 预冷的反应 液中
11、，继续显色 10min 或更久直至全部条带显现出来。 7.终止显色反应：往反应液中加入 1L 固定/终止液，在摇床上反应 23min，终止显色反应。 时间过长会使条带褪色。 8.洗胶：用超纯水漂洗聚丙烯酰胺凝胶 2 次，每次 2min。 9.干胶、观察：通过热对流或室温放置，使胶变干。在白光灯下，也可置于白色或黄色背 景下观察，用单反相机拍照。附表：接头和引物序列编 码接头和引物序列Ead55-CTC GTA GAC TGC GTA CC Ead35-AAT TGG TAC GCA GTC TAC Mad55-GAC GAT GAG TCC TGA G Mad35-TAC TCA GGA CT
12、C AT EA005-GTA GAC TGC GTA CCA ATTC A-3 MC005-GAC GAT GAG TCC TGA GTAA C-3 EA015-GAC TGC GTA CCA ATTC ATC-3 EA025-GAC TGC GTA CCA ATTC AGA-3 EA035-GAC TGC GTA CCA ATTC ACG-3 EA045-GAC TGC GTA CCA ATTC ATG-3 EA055-GAC TGC GTA CCA ATTC AAG-3 EA065-GAC TGC GTA CCA ATTC AAC-3 E015-GAC TGC GTA CCA ATTC A
13、GC-3 E025-GAC TGC GTA CCA ATTC ACC-3 E035-GAC TGC GTA CCA ATTC ACA-3 E045-GAC TGC GTA CCA ATTC ACT-3 E055-GAC TGC GTA CCA ATTC AGG-3 E065-GAC TGC GTA CCA ATTC AGT-3 E075-GAC TGC GTA CCA ATTC AG-3 MC015-GAT GAG TCC TGA GTAA CAG-3 MC025-GAT GAG TCC TGA GTAA CCA-3 MC035-GAT GAG TCC TGA GTAA CTG-3 MC045-GAT GAG TCC TGA GTAA CGA-3 MC055-GAT GAG TCC TGA GTAA CAA-3 MC065-GAT GAG TCC TGA GTAA CTC-3 CMC025-GAT GAG TCC TGA GTAA CAC-3 CMC035-GAT GAG TCC TGA GTAA CAT-3 CMC045-GAT GAG TCC TGA GTAA CTA-3 MC105-GAT GAG TCC TGA GTAA CGT-3
