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1、应用与环境生物学报 2005, 11(2) : 171174 Chin J Appl Environ B iol=ISSN 10062687X 2005204225枯草芽孢杆菌H110对苹果梨采后青霉病和 黑斑病的抑制效果齐东梅 惠 明 梁启美 牛天贵3(中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083)摘 要 将具有广谱拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) H110作为生防菌株,研究了该菌的培养液、 滤液、 菌悬 液及蛋白粗提液对苹果梨(Pyrus bretschneideriRehd. )青霉病(Penicillium expansumLink)和黑斑病(A
2、lternaria alternate) 的抑制效果. H110的蛋白粗提液的抑制作用最好,青霉病和黑斑病的发病率分别比对照低92. 7%和86. 6% ,病斑直径 也显著小于对照;其次为菌培养液和菌悬液,滤液的抑制效果相对较差,但4种处理均显著好于对照. 4种处理对病原 菌孢子萌发的抑制效果与in vivo试验的效果一致.实验结果表明,枯草芽孢杆菌通过产生抗菌蛋白和竞争作用抑制病 原菌生长.图1表2参17 关键词 枯草芽孢杆菌;苹果梨;青霉病;黑斑病;生物防治CLC S476POSTHARVEST BI OLOGICAL CONTROL OF BLUE MOLD AND BLACK SPOT
3、 ON APPLE - PEAR (PYRUS BRETSCHNEIDERIREHD. ) FRUIT BY BACILLUS SUBTIL ISH110Q IDongmei, HU IMing, L I ANGQimei Pyrus bretschneideriRehd. ;Penicillium expansumLink;A lternaria alternate; biocontrolCLC S476果蔬采后损失是一个世界性的突出问题,在发达国家,损失量占采收量的25%左右1,在发展中国家损失量达到50%2.病原菌侵染引起腐烂是采后损失的主要原因,其主要控制手段为使用化学杀菌剂.随着人们
4、对食品和环境中农药残留问题的日益关注,以及多种病原菌对化学杀菌剂已经产生抗性,许多国家已经开辟或正在探索防治果蔬采后病害的新途径35.其中,利用拮抗微生物进行生物防治更是成为研究的热点69.苹果梨(Pyrus bretschneideriRehd. )是我国北方地区的名优特产,品质独特,但极易遭受青霉病菌(Penicillium expansumLink)和黑斑病菌(A lternaria alternata)的侵染而发生青霉病和黑斑病,在贮藏期症状逐渐明显,严重影响果实外观和品质,造成很大经济损失10.已有文章报道,利用拮抗细菌Pseudo2monas cepacia、Pseudom ona
5、s syringae、Pantoea agglom erans和拮收稿日期: 2004211209 接受日期: 2004212202 3 通讯作者 Corresponding author抗酵母菌Cryptococcus laurentii、Cryptococcus infir m o-m iniatus、Rhodotorula glutinis、Trichosporon pullulans、Pichia m em branefa2ciens可以防治果实青霉病和黑斑病7, 1114.枯草芽孢杆菌H110,是本实验室筛选的能有效防治多种植物病害的拮抗 菌15.本研究探讨了枯草芽孢杆菌H110及其
6、不同处理对苹果 梨青霉病和黑斑病的防治效果.1 材料和方法 1. 1 拮抗菌及处理液的制备 芽孢杆菌H110,是从本实验室分离和保存的810株芽孢 杆菌中筛选获得的,具有广谱拮抗作用.经生理生化特征测定 和16S rRNA序列测定,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subti2lis).在LB斜面上活化H110后,取一环于LB培养液中, 100mL /300 mL装液量, 37 下140 r/min振荡培养24 h后,制备 成以下4种处理液:A:培养液 细菌的浓度为n(cfu) =108/mL.B:滤液(培养液于4下8 000 r/min离心10 min后用0. 22m滤膜过滤).C:菌
7、悬液(培养液在8 000 r/min下离心10 min,弃上清, 用无菌水清洗后再离心,加入无菌水,调节菌浓度为n(cfu) =108/mL).D:抗菌蛋白粗提液(培养液于4 下8 000 r/min离心10min弃沉淀,在上清液中加固体(NH4)2SO4至60%饱和度, 4 静置沉淀1820 h后,于4 下10 000 r/min离心20 min,弃上 清液,沉淀用1/25体积5 mmol/L pH 7. 0磷酸缓冲液悬浮).对照(CK)为无菌水. 1. 2 病原菌 梨青霉病菌(P.expansum)、 梨黑斑病菌(A.alternata)、 芒 果炭疽病菌(Colletotrichum g
8、loeosporioides)由中国农业大学食 品学院姜微波教授提供;棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)、 棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporumf .sp.vasinfectum)由中国 农业科学院郭三堆教授惠赠.将病原菌接种于PDA平板, 25 下培养714 d后,用0. 01% Tween 80无菌水溶液配制成浓 度为5104个/mL的孢子悬浮液. 1. 3 果 实 从水果市场购买,选择外观整齐、 无机械损伤、 无病虫害的 苹果梨为供试果实.用75%酒精表面消毒后备用. 1. 4 H110的抑菌谱测定 采用平板对峙法:在PDA平板上接种病原菌, 25 培
9、养7d后,用打孔器取病原菌菌盘(直径8 mm) ,接入另一PDA培 养基中央,四周2. 5 cm处划线接种H110.空白对照不接芽孢 杆菌. 25 培养7 d,测量病原菌直径,计算抑菌率. 抑菌率(r/% ) = (对照病原菌直径-接种芽孢杆菌的病 原菌直径) /对照病原菌直径 100 1. 5 对孢子萌发的影响 用PDB培养液将浓度为2107个/mL孢子悬浮液稀释10倍 后取100L,再分别取培养液、 滤液、 菌悬液和蛋白粗提液100 L,CK为无菌水,混匀后,用凹玻片悬滴法25 培养,15 h后镜检青霉病菌和黑斑病菌分生孢子萌发的情况,每一处理检查200个 孢子,统计各处理病菌孢子的萌发率
10、.每处理3次重复. 1. 6 对梨采后青霉病和黑斑病的抑制作用 用灭过菌的打孔针在苹果梨腰部等距离刺3个3 mm (深) 3 mm (宽)的伤口,分别接种20L上述A、B、C、D处理液和CK . 4 h后再分别接种5104个/mL的青霉菌和黑斑菌的孢子 悬浮液10L.待伤口晾干后,将果实摆放在400 mm300 mm 100 mm塑料框内,外部套塑料袋以保持95%左右的相对湿 度,于25 贮藏.每隔一天测定果实的发病率和病斑直径.每 个处理10个果实,重复3次. 1. 7 试验数据的统计分析 发病率以发病病斑数占接种病菌数的百分率计,病斑直径 采用十字交叉法测量.数据处理采用SPSS统计软件进
11、行Dun2cans多重比较分析.2 结果与分析 2. 1 拮抗芽孢杆菌H110的抑菌作用 植物病原真菌的平板拮抗实验结果(表1)表明,芽孢杆菌H110对梨青霉病和黑斑病、 芒果炭疽病、 棉花黄萎病和枯萎病 等7种植物病原真菌均有较强的抑制作用,为广谱拮抗菌.其 中,对梨青霉病和黑斑病的抑制作用最强,抑菌率达到79. 5% 和86. 4%.而且在芽孢杆菌H110和各病原菌之间存在明显的 抑菌带,说明在对峙培养过程中,H110能产生某种抑菌物质. 2. 2 拮抗芽孢杆菌H110对青霉病和黑斑病菌孢子 萌发的影响 青霉病和黑斑病菌的孢子萌发试验结果(表2)表明, 15 h 后CK处理的孢子绝大多数已
12、经萌发,而芽孢杆菌H110的4 种处理均对孢子萌发有影响.其中以蛋白粗提液对青霉病和黑 斑病孢子萌发的抑制作用最大,孢子萌发率分别只有7%和5% ,其次为培养液和菌悬液.同CK相比,滤液对孢子的萌发 也有显著的抑制作用. 2. 3 芽孢杆菌H110对苹果梨青霉病、 黑斑病的抑制 效果 试验结果表明,芽孢杆菌H110的各种处理均能有效抑制 苹果梨青霉病、 黑斑病对果实的侵染(图1).抑制效果以蛋白 粗提液效果最佳,接种病菌后在25 贮藏7 d,青霉病和黑斑 的发菌率分别比CK低92. 7%和86. 6% ,病斑直径也显著小于CK,分别为3. 2 mm和3. 13 mm. 培养液和菌悬液对病菌的抑
13、制效果次之,二者之间差异不 显著,经培养液处理的苹果梨青霉和黑斑的发病率分别为30%和23. 3% ,病斑直径分别为7. 17 mm和4. 20 mm.菌悬液 处理果实青霉和黑斑的发病率分别为26. 7%和16. 7% ,病斑 直径分别为6. 29 mm和4. 63 mm.滤液同CK相比也有显著的 抑制效果,但相对蛋白粗提液来说较差.3 讨 论 芽孢杆菌是一类在自然界广泛存在的重要微生物类群,其 突出的特征是能产生抗逆性极强的芽孢,这有利于芽孢杆菌作 为生防菌株的生产、 剂型加工及在环境中存活、 定殖和繁殖.应 用芽孢杆菌防治植物病害具有悠久的历史,许多优良菌株已应 用于生产实践来防治果蔬、
14、作物等的真菌、 细菌病害15.其中, 枯草芽孢杆菌以其安全、 对人畜无害、 不污染环境的特点,广泛 用于果蔬采后生物防治,如有文章报道,利用枯草芽孢杆菌可 以防治桃褐腐病和荔枝果腐病16, 17.芽孢杆菌的抑菌作用机制主要为竞争营养物质和物理、 生 物学位点,生成抗菌物质从而对病原菌产生拮抗作用,以及诱 导寄主产生抗病性. 本研究的结果表明,枯草芽孢杆菌H110的无菌滤液具有 一定的抑制作用,说明芽孢杆菌H110能够生成抗菌物质.芽 孢杆菌H110的4种处理中,以蛋白粗提液的抑菌效果最佳, 对孢子萌发的影响也最大,进一步说明该种抗真菌物质为抑制 青霉病和黑斑病的抗菌蛋白.芽孢杆菌H110的培养
15、液、 菌悬 液也有较好的抑制作用,介于蛋白粗提液和无菌滤液之间,说 明芽孢杆菌H110除了通过产生抗菌蛋白,还可能通过营养和 空间竞争来抑制病原菌生长.芽孢杆菌H110的防病效果是由 菌体和胞外抗菌蛋白协同作用的结果,其中起主要作用的是抗 菌蛋白.该抗菌蛋白的分离纯化、 鉴定及其作用机理尚需进一 步研究.271 应 用 与 环 境 生 物 学 报 Chin J Appl Environ B iol 11卷表1 H110的抑菌谱 Table 1 Inhibition ofB.subtilisH110 against seven pathogens病原菌Pathogens抑菌率(r/% )Inhi
16、bition rate病原菌Pathogens抑菌率(r/% )Inhibition rate 梨青霉病菌Penicillium expansum79. 5梨黑斑病菌Alternaria alternata86. 4 芒果炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides64. 2棉花黄萎病菌V991(Verticillium dahliae)75. 6 棉花黄萎病菌V43 (Verticillium dahliae)72. 8棉花黄萎病菌V3 - 10 (Verticillium dahliae)73. 8 棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp . Vasinfectum71. 7表2 几种处理液对青霉病和黑斑病孢子萌发的影响 Table 2 Effect of the treatments on spore germin
