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1、CpG-containing 寡聚脱氧核苷酸寡聚脱氧核苷酸对新化疗药物对新化疗药物 Coramsine 的的抗肿瘤增强效应抗肿瘤增强效应概述概述Coramsine 是一种从 Solanum linnaeanum（devils apple）中提取出来的新的化疗药物临床上主要用 于治疗皮肤肿瘤本实验通过研究 Coramsine 对恶性间皮细胞瘤的小鼠模型的体内抗肿瘤效应来探讨 Coramsine 更广泛的临床应用前景研究发现 Coramsine 全身用药可以延缓肿瘤生长和延长小鼠生存 期并且当 Coramsine 与 ODNs 联用时,未甲基化的 ODNs 作为先天免疫系统的激活物可以增强 Cor
2、amsine 的抗肿瘤效应.两药联用更为有效的延缓了肿瘤的生长和提供生存获益. Coramsine 可能是通过直接裂解细 胞的方式来杀死肿瘤细胞.我们用两种不同的方法来检测凋亡(caspase 激活和 DNA 断裂),没有发现 Coramsine 诱导任何形式的程序化细胞死亡的证据.实验发现, 由 ODNs 增强的 Coramsine 的抗肿瘤效应表 明 Coramsine 介导的细胞死亡是一种与免疫学无关的事件。 关键词关键词化学治疗, CpG 寡聚脱氧核苷酸,免疫治疗, 恶性间皮细胞瘤(J Immunother 2006;29:134-142)细胞毒性化疗仍然是大部分实体肿瘤治疗的最好选择
3、.然而,并非所有肿瘤都对此有效.单一模式的药 物化疗已经很难治愈肿瘤,部分原因是目前的单药治疗容易导致肿瘤细胞产生耐药性.因此有必要探索新的 化疗药物用于以后的化疗或与其他治疗方式的联用上.一般情况下我们通过以下两种思路寻找药物。一是 新药物能够特异性的干扰象细胞繁殖这样的生化途径，如抗代谢药物吉西他滨.二是,新药物中的有效成分 可以在天然复合物中被发现和提取出来，如红豆杉、紫杉酚类的药物。Daunter 和 Cham 在 20 世纪 90 年代发现在澳大利亚昆士兰地区的一种叫做 Solanum linnaeanum （devils apple）的植物可以有效的延缓牲畜皮肤癌的发展在此基础上提
4、出了几种具有细胞毒作用的甾体生 物碱苷类成分。混合物中的两种活性生物碱成分澳洲茄碱和澳洲茄边碱澳洲茄碱和澳洲茄边碱共享一个各种三糖碳水化合物附着 的甾体配基。随后人们把这两种复合物用来治疗表浅的皮肤疾病如角化病、基底细胞癌、和鳞状细胞癌， 并把它推向市场。澳洲茄碱和澳洲茄边碱澳洲茄碱和澳洲茄边碱的混合物最初被称为 SBP002 现在被命名为 Coramsine，体外细胞 实验发现它有更宽的抗癌谱说明其可能有更广的应用范围。 最初人们提出澳洲茄碱和澳洲茄边碱澳洲茄碱和澳洲茄边碱的细胞毒作用是直接裂解细胞直接裂解细胞。现在也有观点认为诱导凋亡诱导凋亡也是 这些生物碱类的细胞毒作用机制。但在我们实验
5、当中，尚未发现支持澳洲茄碱和澳洲茄边碱澳洲茄碱和澳洲茄边碱诱导凋亡的证 据。我们在恶性间皮细胞瘤的小鼠模型上进一步研究了 Coramsine 对实体肿瘤的疗效。实验证明 Coramsine 全身用药可以减缓肿瘤生长和提供适度的生存获益。Coramsine 目前正在由 Australia Special Access Scheme 机构进行临床实验评估。这是一个对未上市药品有选择性的对病人进行临床实验的机构。 近年来，肿瘤化疗逐渐与免疫治疗相结合。我们先前的实验证明抗代谢药物吉西他滨作用于恶性间皮 细胞瘤小鼠模型，可以通过凋亡促进肿瘤细胞死亡并增加了淋巴灌注区（DLNs）肿瘤抗原的表达。吉西 他
6、滨联合对抗抗-CD40 的 FGK-45 抗体激活树状突细胞上的 CD-40 的免疫辅助的治疗方式对肿瘤有很高的 治愈率。目前化疗和免疫结合的综合治疗已经越来越多样化。 比较有前景的免疫治疗方法是通过免疫治疗来激活机体的先天免疫系统。这种治疗方式本质上与 CD- 40 的激活是不同的，后者实际上是一种后天获得性免疫治疗。(postlicensing therapy)，如淋巴灌注区 启动事件后的 T 淋巴细胞的激活。而先天免疫系统的激活会反过来增强启动事件 。先天免疫系统可以被 脂多糖（LPS）、鞭毛素、双链 RNA、和未甲基化的含有 CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸等不同的微生物结构 所激活，机制
7、主要与病原体的分子结构有关。细胞上的受体如 TLRs 识别这些结构并激活先天免疫反应。 在临床前期实验中，我们发现几种 TLR 配体尤其是双链 RNA 以及与之具有相似药代动力学的多聚次黄嘌呤 核苷酸和含有 CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸具有抗肿瘤活性并且在与其他治疗方式联用时具有协同作用 我们发现 Coramsine 对免疫系统有轻微毒性，因此我们研究了其与不同的免疫刺激治疗（如激活 CD40 或多聚次黄嘌呤核苷酸和含有 CpG 结构的寡聚脱氧核苷酸等 TLR 配体治疗）相结合时的治疗获益 。结果发现 Coramsine 与 CpG-ODNs 联用可以降低肿瘤生长速度而与 FGK-45 联用时
8、没有协同作用。材料和方法：材料和方法：1 细胞培养和试剂细胞培养和试剂 鼠 AB1-HA 恶性间皮细胞瘤细胞株贴壁培养在 DMEM 中，DMEM 由 20mM 羟乙基哌嗪乙磺酸，0.05mM 2- 巯基乙醇，100u/mL 青霉素(CSL，Melbourne,Australia），50ug/mL 庆大霉素，(David Bull Labs,Warwick,UK)，和 5%的胎牛血清配制而成。AB1-HA 恶性间皮细胞来源于 AB1 恶性间皮细胞。AB1 细胞是由经石棉诱导的恶性间皮细胞瘤的 BALB/C 小鼠身上得到的。AB1-HA 细胞正常条件下可以逃避免 疫监视。AB1 和 AB1-HA
9、属于高度同源基因。SBP002(Coramsine)由 Solbec Pharmaceuticals 公司提供 （Perth,Western Australia）。消毒蒸馏水稀释 Coramsine 至 200ug/ml，用 3%冰醋酸过滤法消毒。进一步稀 释时均用消毒的一次性蒸馏水。吉西他滨(美国印第安纳波利斯礼来公司生产）由 Sir Charles Gairdner 医院药房提供。将吉西他滨用消毒蒸馏水稀释成 1ug/ml 的原液备用，使用时用消毒蒸馏水稀释。其他材 料均购于 Sigma 公司（Castle Hill,New South Wales,Australia）。 2 2 实验鼠，
10、肿瘤的体内生长和化学治疗实验鼠，肿瘤的体内生长和化学治疗 BALB/C(H-2d)小鼠由澳洲西部的佩思动物实验中心提供，养殖于标准条件下。AB1-HA 细胞 1*106个 皮下接种于实验鼠的一侧下腹部。大约 10-12 天后当肿瘤直径可扪及约 1-2mm 大小时开始用药（day0） 。实验组小鼠腹膜内注射含有不同剂量 Coramsine 的溶液 200 uL。用生理盐水稀 释的乙酸相应的处理对照组。Coramsine 用药期间用双脚规每周 3 次测量肿瘤大小。当肿瘤大小达到 100mm2时，处死小鼠。 3 免疫治疗和免疫治疗和 TLR 配体治疗配体治疗 活化的抗 CD-40 FGK45 抗体实
11、验组小鼠 6 天内分 3 次静脉注射（day4,6,和 day9）含有 FGK45 100ug（由 Antonius Rolink 博士赠送）的 PBS100uL。在 TLR 配体治疗中，当肿瘤可扪及时（day0） ，分别 瘤内注射含有 10ug 的 poly I/C（Invivogen,CA） ，洛索立宾 (Invivogen),CpG1668(5-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3),或非 GpG 操纵的 GpG1720（5-TCCATGAGCTTCCTGATGCT-3）（德国柏林，TIB- MOLBIOL）生理盐水 50uL。每隔 3 天重复一次，用药至 day15。 4 4
12、淋巴细胞及其亚群的细胞数目分析淋巴细胞及其亚群的细胞数目分析 当肿瘤可扪及时（day0），Coramsine 处理 AB1-HA 细胞荷瘤小鼠（14mg/kg）。生理盐水稀释的乙酸 相应的处理对照组小鼠（14mg/kg）。在 day0，1，2，7，8，9，14，15 时向荷瘤小鼠体内腹膜内注射含 有 Coramsine 的溶液 300uL，并在 day3，10，17 时分批处死小鼠。分别收集小鼠脾脏、肿瘤灌注区淋巴结 和对侧淋巴结，制成细胞悬液，并用抗 CD3 和抗 B-220 单克隆抗体荧光标记细胞。将细胞置于 FACScalibur 流式细胞仪检测和 CellQuest and FlowJ
13、o 软件分析结果。通过上述淋巴器官细胞悬液序列稀释， 苔盘兰染色（Sigma）和血细胞仪记数器计算出细胞总数。 5 荧光激活细胞分类器和终端脱氧核苷酸荧光激活细胞分类器和终端脱氧核苷酸转移酶末端标记脱氧尿苷三磷酸盐（转移酶末端标记脱氧尿苷三磷酸盐（TUNEL）分析细胞凋亡和）分析细胞凋亡和 细胞坏死细胞坏死.ApoStat 异硫氰酸荧光素(R图 1A)。当 Coramsine 剂量提高到 14mg/kg 时,重复上述实验,P=0.0008.此剂量不仅可显著延缓肿瘤生长而且在治疗后 15 天还观察 到肿瘤体积的缩小(图 1A)。当用药停止后,肿瘤恢复生长。但在 14mg/kg 剂量组荷瘤小鼠的生
14、存时间显著 延长（P=0.047） 。所有荷瘤小鼠最终都因为肿瘤死亡。 图 1：Coramsine 腹膜内注射延缓了肿瘤生长。当 AB1-HA 肿瘤可触及时，以用药 3 天间隔 4 天的时间方案往 BALB/c 荷瘤小鼠腹膜内注射不同剂量的 Coramsine（12mg/kg 或 14mg/kg，每个剂量组 n=5） ， 。A，可见治疗方案。盲法进行实验。实验组和对照组的肿瘤生长速率（A）和生存曲线（B）如图所示。2 Coramsine 对免疫系统的影响对免疫系统的影响因为许多化疗药物都会对免疫系统产生影响,使淋巴细胞记数降低。本实验在小鼠模型上观察 Coramsine 是否会诱导淋巴细胞记数
15、降低。Coramsine 经腹膜内注射入荷瘤小鼠(n=5,14mg/kg)后,分别于治 疗开始后第 3,10,17 天收集脾脏,肿瘤淋巴灌注区,和对侧淋巴灌注区的淋巴细胞并记数。结果发现对照组荷 瘤小鼠三个区域的淋巴记数在第 3 和 10 天时轻度降低,第 10-17 天时开始升高(图 2A)。而实验组 Coramsine 用药能够导致免疫器官的淋巴细胞记数轻度降低。 （图 2A） 。笔者进一步用荧光标记的抗 CD3 和 B220 抗体 对 Coramsine 处理组的荷瘤小鼠免疫器官的 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞记数。结果显示 Coramsine 处理组的 T 淋巴细胞总数也相应的有略微降
16、低，对侧淋巴灌注区更明显一些（图 2B） 。结果分析，Coramsine 与其他 的化疗药物相比如吉西他滨对免疫系统的影响是非常小的。 笔者通过免疫组化方法观察 CD4、CD8 T 淋巴细胞，B 细胞，和巨噬细胞表达，分析 Coramsine 抑瘤 作用是直接抑制肿瘤细胞还是诱导免疫系统间接抑制肿瘤细胞（图 3） 。结果发现在整个治疗过程中， Coramsine 并没有明显改变肿瘤组织中 CD4、CD8 T 淋巴细胞，B 细胞表达（图 2C） 。实验组和对照组肿 瘤组织内主要的免疫细胞是巨噬细胞（图 3） 。即使实验组的肿瘤生长被 Coramsine 明显延缓时，两组的肿 瘤组织内免疫细胞数量也没有明显差异，此实验结果说明 Coramsine 直接作用于肿瘤细胞。图 2：Coramsine 对免疫系统的影响。接种 AB1-HA 细胞的小鼠（n=5）经腹膜内注射 14mg/kg 的Coramsine 或生理盐水稀释的乙酸。A，示 Coramsine 组和 vehicle 组在 day3，10 和 17 天时脾脏，肿瘤灌注区淋巴结，对侧淋巴结细胞总数
