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1、医学论文医学论文- - 人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究人工关节金属磨损颗粒体外制备分离方法的实验研究【 【摘要摘要】 】 设计一种体外制备、分离人工关节金属磨损颗粒的方法，并验证这种颗粒用于医 学实验的可行性。方法用钛铝钒合金、钴铬钼合金材料分别制成球磨罐(国家 发明专利，申请号：03142073. 7), 球磨罐内装有用同种材料制成的磨块; 向该球磨罐内注入模拟生物体液; 震动球磨得到颗粒混悬液。梯度离心获得金属颗粒。对颗粒进行：(1)元素成分鉴 定；(2)颗粒大小鉴定和粒度分析；(3)扫描电镜对颗粒的表面形态观察；(4)将颗粒 与J774A. 1巨噬细胞共同培养，观察细胞吞
2、噬颗粒的情况。结果通过此方法成功产生并 分离出大量直径1 m左右的钛合金和钴铬钼合金颗粒。(1)元素分析证实整个处理过程中无杂质成 分污染；(2)钛合金颗粒的平均直径Dv901. 009，钴铬钼颗粒的平均直径Dv901. 008，粒度分布曲线基本成正态；(3)扫描电镜图象显示颗粒大小均匀，形状多为不 规则，与体内颗粒极为相似；(4)J774A. 1巨噬细胞能完整吞噬2种材料的颗粒。结论此方法能持续大量产生人工关节 假体金属材料的磨损颗粒，产生的颗粒能在各方面很好地模拟体内磨损颗粒，为 今后人工关节假体松动相关研究的体内、体外研究提供可靠的颗粒来源。 【 【关关键词键词】 】 人工关节 生物相容
3、性材料 磨损颗粒 体内研究 体外研究Abstract：ObjectiveTo design a method of in vitro preparation and seperation for metallic wear particles around joint prosthesis and evaluate its feasibility in medical experiments. MethodTi-6Al-4V and Co-Gr-Mo alloys were used to make two friction jars respectirely. National invent
4、ive patent applied number 03142073.7.Lots of quadrate blocks made of the same materials are put into the jars respectively, which were then. lubri cated by manmade body fluid and vibrated on a bottle shaker. After 21 days the fluid was harvested and centrifuged to get the produced wear particles. Th
5、e collected particles were studied by using element trace analysis, laser countersizer and scanning electron microscopy. The J774.A1 macrophages cultured together with these particles for 24 hours were observed under inverted phase contrast microscopy and transmission electron microscopy.ResultA got
6、 great amounts of metallic particles with 1m diameter coned beproduce using this method. The aver age diameter of titanium alloys (Dv90) is 1.011 and that of CoGrMo is 1.010. Particle size distribution had good consistency in different materials. Under scanning electron microscopy ,the particles had
7、 irregular shapes just like those got from revision operations. The particles taken into the J774.A1 macrophages could be seen under inverted p hase contrast microscopy and transmission electron microscopy.ConclusionThis method is good enough to producl lots of metallic wear particles mosth like tho
8、se around total joint prosthesis and can be used in further in vivo and in vitro studies about joint prosthesis loosening.Key words：artifitial joint; biomechanical receptive material; wear particle; in vivo; in vitro人工关节假体晚期松动是长期困扰骨科领域的难题。长期的研究形成共识：假体 材料磨损颗粒引发的由巨噬细胞介导的破骨细胞性骨吸收是假体松动的主要生 物学原因1。随着各种新型生
9、物金属材料的不断产生和人们对金属- 金属人工关节假体的重新评价，细小金属颗粒在假体松动中的作用又成为了研 究的热点2，3。为解决人工关节松动相关研究中颗粒来源匮乏的问题，本研究 在参考Rogers4方法的基础上设计出一种体外产生生物金属材料细小磨损颗粒 的方法，采用此方法成功制成了直径1 m的钛合金和钴铬钼合金颗粒。并对颗粒的成份、大小、形态和粒度分布进行分 析观察。颗粒与巨噬细胞体外培养中观察吞噬的方法初步验证颗粒用于医学实 验的可行性。1 材料与方法材料与方法1. 1 颗粒制备装置的研制原料选用医用钛铝钒合金（上海思爱高科技开发有限公司提供）和钴铬钼合金（北 京力达康科技有限公司提供）。采
10、用非焊接技术制成3个中空的椭球形球磨罐（10 0 mm70 mm70 mm）和立方形磨块若干（5 mm5 mm5 mm）。顶部开口处采用螺纹旋入式顶盖，加用聚乙烯的垫圈，以提高系统的密封 性能，在设计上确保聚乙烯垫圈不外露于容器的内壁，以防止混入聚乙烯磨损颗 粒。底部支架使磨罐能在平面放置（图1、2）。本装置的所有组件按ASTM F86- 76标准进行清洗，75%酒精浸泡，高温灭菌（121、15 min）后备用。生物金属颗粒产生装置及分离保存方法已申请国家发明专利。发明名称：一种生物金属材料超细粉末的制备方法及其制备装置。专利申请号：03142073. 71. 2 磨损颗粒的制备、离心分离与保
11、存无菌条件下打开顶盖，将磨块放入球磨罐中，加入事先配制好模拟生物体液（PBS +2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 g/ml链霉素）75 ml作为润滑液。装置至于摇床上，摇晃72 h，弃掉润滑液，重新加入润滑液75 ml，摇晃21 d。收集润滑液与磨损颗粒的混悬液，加润滑液至80 ml待用。将钴铬钼合金混悬液80 ml分装在8个10 ml的试管中，500 r/min离心2 min，弃沉淀物，重新加润滑液至10 ml，重复2次。1 000 r/min离心5 min，弃上清，重新加润滑液至10 ml, 重复1 000 r/min离心5 min 1次，加润滑液至4 ml, -20冻存备用。将钛合
12、金混悬液80 ml分装在8个10 ml的试管中，500 r/min离心4 min，弃沉淀物，重新加润滑液至10 ml，重复2次。1 000 r/min离心40 min，弃上清，重新加润滑液至10 ml, 重复1 000 r/min离心40 min一次，加润滑液至4 ml, -20冻存备用。1. 3 磨损颗粒成分元素分析随机抽样选取钛铝钒合金原料和磨损颗粒样品各一份进行元素分析。秤取0. 1 g原料和磨损颗粒样品，于聚四氟乙烯烧杯中，加入10 ml HF（分析纯），加热1 h，加入10 ml H2SO4(GR), 加热1 h，定容于500 ml容量瓶中。取液进入等离子体发射光谱仪（IRIS Ad
13、vantage 1000 美国），仪器自动读出样品元素组成。1. 4 磨损颗粒的粒度分析用润滑液（PBS+2%小牛血清+5 IU/ml青霉素+5 g/ml链霉素）进入激光粒度仪（TSL100 上海理工大学研制）校准调零。取颗粒混悬液4 ml, 在旋涡混合器上充分混匀，进入激光粒度仪，计算机自动颗粒浓度、粒度数据和 粒度分布曲线。1. 5 磨损颗粒的扫描电镜观察取颗粒混悬液50 ml，滴加到孔径为0. 22 m的滤膜上，烘干48 h后表面真空离子喷金，扫描电子显微镜（QUANTA200 荷兰）进行观察并摄取图像。1. 6 巨噬细胞培养与吞噬实验J774A. 1巨噬细胞株来源于BALB/c小鼠网状
14、细胞肉瘤，由American Type Culture Collection Co. （Rockville, MD, USA）提供，培养在含10%小牛血清、100 g /ml青霉素、100 g /ml链霉素和2%谷氨酰胺的DMEM培养液，于37 、5%CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数生长期的细胞，以2105/ml接种于6 孔板中，培养46 h后，加入体外制备的钴铬钼合金颗粒混悬液（107个/孔），另外于35 mm培养皿中按上述方法接种细胞，刺激24 h后用2. 5%戊二醛溶液固定，进行倒置相差显微镜观察。同时设置不加任何刺激物的对 照孔。1. 7 巨噬细胞透射电镜观察J774A. 1巨噬细
15、胞分别加入钴铬钼合金颗粒混悬液和钛铝钒合金颗粒混悬液（107个/孔） ，作用24 h后用2. 5%戊二醛溶液固定。用橡皮刮子将全部细胞从皿底轻轻刮下，收集在离心管中离心2 000 r/min 20 min，弃上清，将沉淀的细胞团块取出，用棉花纸包裹起来，然后进行漂洗、1%锇 酸后固定15 min、漂洗、脱水、浸透，将样品从棉花纸内取出进行包埋，60烘箱内48 h，超薄切片，透射电镜（HITACHI H-500 日本）观察并摄像。2 结结 果果2. 1 磨损颗粒成分元素分析分析结果显示：实验中获得的钛铝钒合金颗粒的元素构成与其原料基本相同（表1 ），证实磨损颗粒的产生过程中无杂质元素污染。 表1 钛铝钒合金磨损颗粒的元素分析结果2. 2 磨损颗粒的粒度分析钛铝钒颗粒的平均直径Dv901. 009，99. 93%的颗粒直径在0. 31. 2 m之间；钴铬钼颗粒的平均直径Dv901. 008，99. 93%的颗粒直径在0. 31. 2 m之间；2种颗粒粒度分布曲线形态非常相似（图3、4）。2. 3 磨损颗粒的扫描电镜观察镜下可见体外制备的钛铝钒合金颗粒呈片状、盘状、柱状、针状等各种不规则形 状，表面有低密度的血清蛋白沉积（图5）。未见明显的颗粒叠加和成团聚集的情 况。大小颗粒在滤膜上分布不均匀，大颗粒集中在边缘上，小颗粒集中在中心部 位。体外制造的钴铬钼合金颗粒也有片状、盘状、
