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1、 生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2010, October 25; 26(10): 13721378 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 2010 CJB, All rights reserved. Received: June 15, 2010; Accepted: August 15, 2010 Supported by: National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2006A
2、A02Z237). Corresponding author: Yin Li. Tel/Fax: +86-10-64807485; E-mail: 国家高技术研究发展计划 (863 计划) (No. 2006AA02Z237) 资助。 细胞工厂的构建技术 丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统 董红军，张延平，李寅 中国科学院微生物研究所，北京 100101 摘 要: 丙酮丁醇梭菌是极具潜力的替代燃料 生物丁醇的合成菌，受到各国研究者的普遍关注。丙酮丁醇梭菌菌株改造是生物丁醇产业化进程中的一项重要工作，其中遗传操作是核心内容之一。以下对丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统的发展历史、种类和原理进行了综述，分析了目
3、前几种遗传操作系统的局限性，并对其发展进行了展望。 关键词: 丙酮丁醇梭菌，丁醇，菌株改造，遗传操作系统 Genetic modification systems for Clostridium acetobutylicum Hongjun Dong, Yanping Zhang, and Yin Li Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China Abstract: Clostridium acetobutylicum, a biofuel-butanol producer, has
4、 attracted worldwide interests. Strain improvement is important for the process of biobutanol industrialization where efficient genetic modification systems are essential. In this review, the history of genetic modification systems of C. acetobutylicum was introduced, and the types and principles of
5、 these systems and their disadvantages are summarized and analysed. The development of updated genetic modification systems for C. acetobutylicum is also proposed. Keywords: Clostridium acetobutylicum, butanol, strain improvement, genetic modification systems 丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等，全球年需求量超过
6、140 万 t。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛烷值与汽油相当； 含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道、不易吸水，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且与汽油有很好的混合性。 生产丁醇有两种方式，一种是通过化工方法从石油中提炼。这种方法是目前市场上丁醇的主要来源。但随着石油作为不可再生资源，储备量急剧减少，且价格节节攀高，生物法生产丁醇作为石化法生产的替代方式受到越来越多的关注。 产丁醇的微生物包括丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum、拜氏梭菌C. beijerinckii、 C. saccharoperbutylacetonicum和
7、C. saccharobutylicum 等菌株，其中对丙酮丁醇梭菌 C. acetobutylicum 的研究最广泛和深入。微生物生产丁醇的主要问题是产物浓度低、产率低、分离成本高，因此生物丁醇的生产需要对现有的发酵体系及菌株进行改造，才有可能满足工业化需求。传统的菌株改造是基于诱变的随机筛选， 工作量大，而且经过过去长期诱变筛选，其提升丁醇生产能力董红军等: 丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统 1373 J 的空间已经很小。2001 年丙酮丁醇梭菌基因组的测序完成1，为研究者们对丁醇生产进行系统生物学的研究提供了可能。现在转录组学2、蛋白组学3、代谢网络模型4-6等方面都有广泛的研究报道。虽然现在
8、对丙酮丁醇梭菌产丁醇的认识已经有了很大的进步， 但是通过菌株改造来提升丁醇生产能力的工作却进展不大。 主要原因是由于厌氧梭菌的遗传操作比较困难， 转化效率低 (103105转化子/g DNA)7， 传统的同源重组方法难以进行。虽然目前已经有梭菌遗传操作成功的报道，但是往往效率不高或使用范围受限，遗传操作工具的高效性仍是目前产丁醇菌株改造的一个制约因素。本文主要以丙酮丁醇梭菌模式菌株 ATCC824 为介绍对象， 对其遗传操作系统的发展历史及原理进行了总结，分析了其局限性，并对未来的发展进行了展望。 1 丙酮丁醇梭菌的转化 由于丙酮丁醇梭菌不具备自然转化的能力，所以将外源 DNA 导入到梭菌细胞
9、内就需要采取物理或化学的方法。Truffaut 等8利用制备原生质体的方法对丙酮丁醇梭菌 NI-4081 菌株进行了转化，其方法是在含蔗糖的培养基中培养细菌，待生长到一定阶段后利用溶菌酶和青霉素 G 去除细胞壁，然后在聚乙二醇溶液中进行转化。但原生质体制备、转化和原生质体再生过程比较复杂、耗时，目前比较常用的仍是操作简单的电转化方法。电转化法是指细胞在瞬间的高压电场中，细胞膜可以形成空隙，从而使得外源 DNA 进入到细胞内。 Mermelstein 等使用的方法7是目前最为通用的方法，其主要内容为使用ETB 溶液 (272 mmol/L 蔗糖溶液 (pH 7.4)， 5 mmol/L NaH2
10、PO4) 作为电转溶液，电转参数为电压 25 kV，电容 25 F，电阻，电击杯 0.4 cm，转化效率最高可达 105个转化子/g DNA。由于丙酮丁醇梭菌是严格的厌氧菌，所以制备感受态细胞的过程是在厌氧条件下 (厌氧箱内) 完成的， 目前还没有在有氧条件下成功转化丙酮丁醇梭菌的报道。 Tyurin 等利用特制的电转仪对丙酮丁醇梭菌进行了方波高压脉冲 (电压 12 kV; 脉冲持续时间为22.5 ms，脉冲频率 100 kHz) 电转化9，使得梭菌的转化效率超过 106个转化子/g DNA，是目前报道的最高转化效率，然而由于这种特制的电转仪还没有商业化，所以研究丙酮丁醇梭菌通常使用的还是Me
11、rmelstein 等的方法7。 限制修饰系统 (Restriction-modification system) 是自然界很多细菌中存在的一种细菌免疫系统，用于降解入侵的外源 DNA，保护自身 DNA。在丙酮丁醇梭菌的模式菌株 ATCC824 中也存在着一种名为 Cac824I 的二型限制修饰系统，识别-GCNGC-位点。大多数来自大肠杆菌的质粒由于这个位点上没有甲基化保护且具有多个拷贝，所以这样的质粒是不能够转化梭菌的。Mermelstein 等利用表达有来自枯草芽胞杆菌噬菌体 3tI甲基化酶的大肠杆菌进行质粒的甲基化修饰，第一次实现了来自大肠杆菌的质粒的成功转化7,10。 作者根据发表的
12、丙酮丁醇梭菌ATCC824 的基因组信息及 REBASE 网站的预测， 选择 CAC1502 基因， 利用二型内含子的方法对其进行了失活，得到的突变体菌株 SMB009 转化时质粒不再需要特异的甲基化修饰11。在丙酮丁醇梭菌中，限制修饰系统可能是不能利用接合方法进行基因转移 (Gene transfer) 的一个关键因素，SMB009 菌株将可能实现梭菌的接合操作。 2 丙酮丁醇梭菌中的复制型质粒及表达质粒 1989 年，Truffaut 等最早证明了 pIM13、pT127、pBC16可 以 通 过 电 击 转 化 导 入Clostridium acetobutylicum N1-4081
13、中12，并构建了 E. coli-C. acetobutylicum 穿梭型质粒，Azeddoug 等也利用pIM13 构建了新的穿梭载体，使用 PEG 介导的原生质体转化方法转化13。1990 年 Williams 等把来自pAM1 (Enterococcus faecalis)、pCB101 (C. butyricum)、pWV01 (Streptococcus cremoris) 的复制子与 RK2 型oriT 片段相连接，构建成可接合的穿梭型质粒，首次成功地利用了 IncP 型质粒的接合原理，将质粒导入 C. acetobutylicum NCIB 8052 (现定名为C. beije
14、rinckii NCIMB 8052)中14。但是对于其他的丙酮丁醇梭菌如 ATCC824、DSM1731、DSM792 等均未见有利用接合方法导入质粒的报道，所以这种方法可能只适用于 C. beijerinckii。上述复制型质粒1374 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech October 25, 2010 Vol.26 No.10 J 都是来自非梭菌的菌株，1990 年 Yoshino 等首次将分离自 C. acetobutylicum strain No. 86 的质粒 pCS86 (3.0 kb) 改造成了可与 E. coli 穿梭的质粒，
15、成功转化了不含质粒的 C. acetobutylicum strain No. 22015。1992 年 Lee 等利用来自链球菌的质粒 pMU1328， 来自丁酸梭菌的 pCBU2，来自 C. perfringens 的 pJC4、pJU22，来自 Streptococcus faecalis 的 pAM1，来自Bacillus subtilis 的 pIM13 质粒构建了 pSYL2、pSYL7、pSYL9、pSYL14 四个穿梭质粒，由于ATCC824 中限制修饰系统的限制， 只有 pSYL2 可以成功转化，而这 4 个质粒都可以以 81026103个转化子/g DNA 的效率转化 NCIMB805216。 目前在ATCC824菌株使用的大多数质粒是衍生自 pIM13或pAM1。 3 丙酮丁醇梭菌中的基因失活策略 基于 Mermelstein 等报道的丙酮丁醇梭菌电转化方法7， Green 等首次利用自杀质粒成功地在梭菌中实现了基因敲除17。然而由于梭菌的转化效率较低，利用自杀质粒进行同源重组的成功率极低，所以后来发展出了以复制型质粒为基础的反义 RNA抑制、复制型质粒同源重组及二型内含子基因敲除技术。2010 年作者构建的限制修饰系统缺陷型菌株SMB009 使得这些操
