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1、由于是比较畸形菇和正常菇，又因为畸形菇是由于 CO2 溶度过高引起的，所以 旨从呼吸作用入手，试拟了与呼吸作用相关的物质和酶的测法，探究畸形菇和 正常菇的区别和联系，从而再深层次的研究畸形菇。猴头菇呼吸强度的测定（小篮子法）猴头菇呼吸强度的测定（小篮子法）【实验原理】 利用 Ba(OH)2溶液吸收呼吸过程中释放的 CO2，实验结束后，用草酸溶液滴定 残留的 Ba(OH)2，从空白和样品两者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程 中释放的 CO2量。【器材与试剂】 1.实验仪器 广口瓶，温度计，酸式滴定管，干燥管尼龙网制小篮 2.实验试剂 0.05mol/L Ba(OH)2溶液(8.856 g/L
2、） ，指示剂（0.1%麝香草酚酞乙 醇 溶液） ，1/44mol/L 草酸溶液（准确称取重结晶的草酸 H2C2O42H2O 2.865g 溶 于蒸馏水，配成 1000mL，每 mL 溶液相当于 1mg 的 CO2） 。 3.实验材料 猴头菇【实验步骤】 1.去两个 500mL 广口瓶，每个都装配一只三孔橡皮塞，一孔插入盛碱石灰的干 燥管（在干燥管底部放适当脱脂棉，上置碱石灰） ，以吸收空气中的 CO2，保证 金如呼吸瓶中的空气无 CO2，一孔插入温度计，另一孔直径约 1cm，供滴定用， 滴定前用小橡皮塞塞紧。瓶塞下面挂一尼龙网制小篮，用以盛实验材料。 2.称取两份猴头菇材料，其中一份用沸水煮死
3、，分别装入小篮内，将小篮挂在 广口瓶内，同时加 0.05mol/L Ba(OH)2溶液 25mL 于广口瓶内，立即塞紧瓶塞， 防止漏气。每 10min 左右，轻轻地摇动广口瓶，破坏溶液表面的 BaCO3薄膜， 以利对 CO2的吸收。 3.1h 后小心打开瓶塞，迅速取出小篮，在每个广口瓶中分别加入 2 滴指示剂， 立即重新塞紧瓶塞。然后拔出小橡皮塞，将滴定管插入小孔中，用 1/44mol/L 草酸溶液滴定，直到蓝绿色转变成无色为止。分别记录滴定所耗用的草酸溶液 体积（mL） 。 4.以沸水煮死的猴头菇为对照进行呼吸强度的计算。 5.计算呼吸强度CO2，mL/(gh)=（V0-V1）/猴头菇鲜重（
4、g）*时间（h）式中：V0为装煮死的猴头菇的广口瓶中，所耗用草酸的体积，单位是 mLV1为为处理的猴头菇的广口瓶中，所耗用草酸的体积，单位是 mL过氧化氢含量的测定 【原理】 H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物钛复合物黄色沉淀，可被 HSO4溶解后，在 415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与 H2O2浓度呈线性关系。【仪器和用具】 研钵；移液管 0.2ml2 支，5ml1 支；容量瓶 10ml7 个，离心管 5ml8 支；离心机；分光光度计。【试剂】 100mol/L H2O2丙酮试剂：取 30%分析纯 H2O2 57l，溶于 100ml，再稀 释 100 倍；2mol/
5、L 硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】1.制作标准曲线：取 10ml 离心管 7 支，顺序编号，并按表 40-1 加入试剂。表 40-1 测定 H2O2浓度标准曲线配置表 离 心 管 号试剂（ml）1234567100mol/L H2O200.10.20.40.60.81.04下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1 浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min 离心 10min，弃去上清夜，留沉淀 2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入 10ml
6、容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲 洗离心管，将洗涤液合并后定容至 10ml 刻度，415nm 波长下比色。2.样品提取和测定：(1)称取猴头菇 25g（视 H2O2含量多少而定） ，按材料 与提取剂 11 的比例加入 4下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入 离心管 3000 r/min 下离心 10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移 液管吸取样品提取液 1ml，按表 35-1 加入 5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后 3000rpm/min 离心 10min，弃去上清液。(3)向洗涤后的沉淀中加入 2mol 硫酸 5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果
7、计算：植物组织中 H2O2含量(mol/g Fw)=CVt FWV 1 式中 C标准曲线上查得样品中 H2O2浓度（mol） ；Vt样品提取液总体积（ml） ；V1测定时用样品提取液体积（ml） ；FW植物组织鲜重（g） 。二、过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法 【原理】 H2O2在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶 液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶 1 个；0.5ml 刻度吸管 2 支， 2ml 刻度吸管 1 支；10ml 试管 3 支；恒温水浴；
8、【试剂】 0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮） ； 0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定） 。【方法】 1.酶液提取：称取猴头菇 0.5g 置研钵中，加入 23ml 4下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗 研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置 5冰箱中静置 10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。 5下保存备用。 2.测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表 40-2
9、顺序加入试剂。表 40-2 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表 管 号S1S2S3 粗酶液(ml)0.00.20.2 pH7.8 磷酸(ml)1.51.51.5 蒸馏水(ml)1.01.01.025预热后,逐管加入 0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅 速倒入石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算： 以 1min 内 A240减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（u） 。过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FWtV.VAT 1240 10式中 A240
10、= AS0()AASS12 2AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2样品管吸光值；Vt粗酶提取液总体积（ml） ；V1测定用粗酶液体积（ml） ；FW样品鲜重（g） ；0.1A240每下降 0.1 为 1 个酶活单位（u） ；t加过氧化氢到最后一次读数时间（min） 。【注意事项】 凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。三三.超氧化物歧化酶（超氧化物歧化酶（SODSOD）活性的测定）活性的测定【试剂】1.0mol/LHCL1.0mol/LHCL1.0mol/LHCL 母液，母液，母液，TrisHCL 缓冲液，0.01mol/L HCL，0.05mol/L 邻苯三酚液【方
11、法】）酶液的制备 按每克菌丝加入预冷的 TrisHCL 缓冲液，于冰浴中研磨成匀浆，定容到 刻度离心管中，于 8500r/s 冰冻离心 30min，上清液即为 SOD 粗酶提取液。将 10%的 粗酶提取液用缓冲液稀释 200 倍，得到 0.5%的粗体液。 ）邻苯三酚自氧化速率的测定 将两支试管按表加入缓冲液，于保温 10min，加入预热的邻苯三酚液，迅速 摇匀（空白以 0.01mol/L HCL 代替邻苯三酚液） ，倒入比色皿内，在 420nm 波长 下于恒温池中每隔 30s 测吸光值一次。计算线型范围内每 1min 吸光的增值，此 即为邻苯三酚自氧化速率。 试剂空白管自氧化管样品管 TrisHCL 缓冲液3.03.03.0 H2O0.140.1 0.05mol/L 邻苯三 酚液40uL40uL样品0.1 总体积3.143.143.14 ）酶活测定 测定方法与邻苯三酚自氧化速率自氧化速率相同，再加入邻苯三酚前，先加入待 测酶稀释液。通过控制样品的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定系后，使邻苯 三酚自氧化速率自氧化速率被抑制 50%。）酶活力的计算 SOD 酶活力单位定义：在规定条件下，反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自 氧化速率自氧化速率时的酶量定义为一个酶活力单位（） 。 SOD 活力（U/mL）（0.070）0.035100%总样液稀释 倍数（50%样）
