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1、医学论文医学论文- - 体外消化透析法测定朱砂中汞生物可接受率的实验条件确体外消化透析法测定朱砂中汞生物可接受率的实验条件确 定定作者：庞京团 胡广林 韩彬 齐江宁 李平【 【摘要摘要】 】 目的确定体外消化透析法测定朱砂中汞的生物可接受率的实验条件，建立实验 流程，并测定朱砂中汞的生物可接受率。方法模拟胃肠消化环境，研究pH、接触 时间等因素对朱砂中汞的溶出率及透析时间等对朱砂中汞的生物可接受率的影 响规律，确定合适模拟条件。结果确定的实验流程模拟条件为：液/固比100，人工 胃液pH=1.5，加入0.16%胃蛋白酶1 ml，接触时间100 min，透析时间100 min，加入胰液胆盐混合物
2、量为5 ml。在确定的实验条件下，CV- AFS测得水飞朱砂中汞的溶出率为2.510- 6（n=6，RSD4.1），生物可接受率为4.810-7 (n=6，RSD3.5)。结论体外消化透析法可用于测定朱砂中汞的生物可接受率， 可为测定含朱砂中成药中汞的生物可接受率提供方法学上的参考。 【 【关关键词键词】 】 体外消化透析法； 朱砂； 生物可接受率； 汞Abstract：ObjectiveTo determine the simulated conditions for estimating the bioaccessibility of mercury from cinnabar by me
3、ans of an in vitro digestion and dialysis.MethodsIn order to determine the appropriate simulated conditions, we simulated gastrointestinal digestion environment, and studied the effects of contact time,the pH of artificial gastric juice, addition of pepsin, dialysis time, addition of pancreatin bile
4、 salt mixture.ResultsThe simulated conditions were determined as follows: liquid/solid of 100, the pH value of 1.5 in artificial gastric juice, 1 ml pepsin which contained 0.16 g pepsin per ml, contact time of 100 min, 5 ml pancreatin bile salt mixture which contained 0.004 g pancreatin and 0.025 bi
5、le salt per ml,dialysis time of 100 min. We estimated the bioaccessibility of mercury from cinnabar by CV- AFS, and the mercury dissolution rate and bioaccessibility from cinnabar showed high repeatability, dissolution rate was about 2.510-6(n=6,RSD4.1), and the bioaccessibility was about 4.810-7(n=
6、6,RSD3.5).ConclusionThe in vitro digestion and dialysis are suitable for estimating the bioaccessibility of mercury from Chinese traditional patent medicine which contains cinnabar.Key words：In vitro digestion and dialysis； Cinnabar； Bioaccessibility； Mercury朱砂又名丹砂、辰砂等，始载于神农本草经，列为上品药，主含硫化汞(HgS)；其 性微
7、寒，有毒，归心经，有镇心安神、清热解毒之功，主治心神不宁、心悸消渴等 病症1 。近年来关于朱砂及含朱砂中成药对肾脏、中枢神经系统及生殖系统的毒性屡见 报道2 。目前，国际上对中药中重金属的毒副作用已相当重视，FDA和WHO均制定了类似食品、蔬菜以及茶叶等产品的重金属允许摄入量。美国、欧盟、日本等国家及 我国传统中药出口的东南亚地区都制定了严格的重金属限量标准。但是，包括我 国在内，所有针对汞制定的限量标准都只考虑了汞总量，这显然不能说明问题。 对于以HgS为主要成分的矿物药朱砂，以汞总含量对其评价显然是片面的，因而 如何合理评价朱砂及含朱砂中成药中汞的安全性已经成为一个亟待解决的问题 ，对朱砂
8、中汞进行安全性评价就具有了重要的现实意义。体外消化透析法(in vitro Digestion and Dialysis)是通过模拟人体内消化环境，对营养物质被人体吸收利用部分进行评估 的方法。此实验法有很多的优点，它较之动物实验更有说服力，和人体实验相比 耗费小，简便易操作。近年来，科研人员在评价元素生物可接受率方面做了大量 工作，体外消化透析法已经被广泛应用于测定食品中Fe，Ca，Zn3，4 等营养元素和环境中Pb、Cd4，5 等重金属元素的生物可接受率，并证实体外消化透析法测得的生物可接受率与 人体吸收利用有较好的相关性。关于生物可接受率影响因素的报道很多，M. Waisberg6 等报
9、道了pH值和接触时间等对Cd元素生物利用性有显著影响。本实验研究了朱 砂中汞溶出率和透析率的主要影响因素，分析实验结果并结合人体消化环境实 际情况确定了体外消化透析法各主要影响因素的实验条件，建立了一种测定朱 砂中汞生物可接受率的体外消化透析法实验流程，CV- AFS测定了朱砂中汞生物可接受率，并对朱砂安全性做了定性的说明。1 仪仪器与材料器与材料1.1 仪器 SYG- 型智能冷原子荧光测汞仪（杭州大吉光电仪器有限公司）；MRG- 70分装式高压密封消化罐（沈阳森华理化仪器研究所）；pHS- 25型酸度计（上海伟业仪器厂）；THZ- 82型水浴恒温振荡器（江苏天由有限公司）；101- OS型数
10、显式电热恒温干燥箱（上海沪越实验仪器有限公司）；FA1004N电子天平（ 上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂）。1.2 试剂 胃蛋白酶（上海国药集团化学试剂有限公司，BR）；胰蛋白酶（上海楷洋生物技术 有限公司，BR)；猪胆盐（上海国药集团化学试剂有限公司，BR）；透析袋截留分子 量（Molecular Weight Cut-off,MWCO）1200014000 Da（上海双向西巴斯科技发展有限公司）；HNO3，HF，HCl，SnCl2为GR级试剂，K H2PO4，NaHCO3，NaOH为AR级试剂，水飞朱砂（按2005年中国药典的硫氰酸 铵法测得HgS含量98.3）；汞标准贮备液（100g
11、ml- 1国家环保总局标准样品研究所）；杨树叶标准物质（GBW 07603）由地矿部物化探研究所提供；实验用水为二次亚沸蒸馏水。2 方法方法2.1 溶液的制备2.1.1 人工胃液 二次亚沸蒸馏水稀释13 molL-1HCl至pH=1.50，待用。2.1.2 胃蛋白酶 取1.6 g胃蛋白酶溶于10 ml 0.1 molL-1 HCl，配制成质量浓度为0.16gml-1胃蛋白酶7 ，现配现用。配制1 molml-1NaHCO3，6 molml-1HCl，0.1 molml-1NaOH， 0.1 molml- 1NH4SCN，2%FeSO4，1%KMnO4，0.2%NH4Fe(SO4)，6 molm
12、l-1 NaOH等水溶液待用。2.1.3 人工肠液 取KH2PO46.8 g，加水500 ml溶解，用0.1 molL- 1NaOH水溶液调节pH值至6.8。2.1.4 胰液胆盐混合物 0.180 g胰蛋白酶、1.125 g胆盐溶于45 ml人工肠液，配制成胰蛋白酶、胆盐质量浓度分别为0.004 gml-1和0.025 gml- 1的胰液胆盐混合物7，现配现用。2.2 胃消化环境模拟实验 准确称取一定量朱砂加入人工胃液，搅拌呈匀浆状，加入胃蛋白酶，（371），8 0 rmin-1条件下振荡，一定时间后，离心，取上清液。2.3 肠吸收环境模拟实验 将胃消化环境实验所得样品进行酸度滴定，确定所需要
13、NaHCO3量。将实验中确 定NaHCO3水溶液量加入到透析袋中，置透析袋于胃消化实验所得样品中，（37 1），80 rmin- 1条件下振荡，pH值达到5.0后9，向样品中加入胰蛋白酶胆盐混合物，继续振荡 ，开始计时，一定时间后，收集透析液。2.4 汞的测定方法 所得样品均用高压密封消解-CV-AFS测定汞含量8。2.5 数据处理 测定朱砂溶出汞量以及透析汞量，参照文献中计算Zn，Fe元素生物可接受率的方 法9，生物可接受率可由肠消化环境下测得的透析率表示。朱砂中汞溶出率以 及生物可接受率公式如下：a=BA100% b=CA100%公式中a、b 分别表示朱砂中汞的溶出率和生物可接受率，A、B
14、、C分别表示朱砂中汞在朱砂 中总汞量、胃模拟阶段朱砂中溶出量、朱砂中汞在肠模拟阶段透析量。3 结结果与果与讨论讨论3.1 胃消化环境模拟条件确定 体外消化透析法在模拟胃消化阶段主要考虑影响因素有液/固比、pH值、加入酶量、接触时间。本文为提出朱砂中汞安全性评价实验方法，在实验条件的选择中 ，我们在保证与人体环境尽可能接近的同时选择汞溶出率最高的实验条件。在研究液/固比对朱砂中汞溶出率影响的实验中，本实验分别选用液/固比为100， 200，300，400，500，600，800，1 000，测定不同液/固比下朱砂中汞溶出率10。以液/固比为横坐标，朱砂中汞溶 出率为纵坐标，见图1。实验结果显示，
15、液/固比在1001 000范围内汞溶出率为（250191）ngg- 1，P0.05，影响不显著，实验中液/固比选择为100。在研究pH对汞溶出率的影响实验中，考虑到人体胃消化环境pH值变化范围为1 511，实验中用6 molL-1 NaOH和6 molL-1 HCl水溶液调节待加入人工胃液的pH为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，5.0，测定 不同pH值下汞溶出率。以pH值为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图2，实验 结果发现：pH值对朱砂中汞溶出率有很显著的影响，变化趋势与文献报道类似7 ，不同的是文献报道pH2.0时溶出率变化不大，低于2.0时变化明显，我们发现p
16、H2.5时，随pH增大溶出率变化不大，pH0.05，无显著影响，与曾克武12报道加入蛋白酶量影响朱砂中汞溶出率不 显著相似。因此，实验中加入0.16 gml-1胃蛋白酶1 ml。在研究接触时间对朱砂中汞溶出实验中，我们分别测定了15，30，45，60，75，90 ，105，120 min朱砂中汞溶出率。以时间为横坐标，朱砂中汞溶出率为纵坐标，见图4。实验 结果表明，朱砂中汞溶出率在060 min阶段缓慢增大，在6075 min阶段很快增大，在7590 min缓慢增大，90120 min基本不再变化，溶出趋于平衡。对于朱砂的体外消化模拟研究，在保证溶出达 到平衡条件下，应尽量减少接触时间。根据实验结果，我们选100 min作为胃消化模拟的接触时间。 图1 液/固比对朱砂中汞溶出
