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1、学院代号 10716 学号 110050801108 专业代码 081302 密级公开陕 西 中 医 学 院Shaanxi University of Chinese Medicine 学士学位论文对天然多糖的抗氧化活性研究学位申请人曹柯专业名称制药工程申 请 学 位 类 型工学学士学位指 导 教 师 姓 名王露老师论 文 提 交 日 期2013 年 6 月对天然多糖的抗氧化活性研究姓名：曹柯指导老师：王露老师【摘 要】 ： 多糖是一大类广泛存在于动植物和微生物体内的生物高分子物质， 许多天然多糖具有增强免疫、抗氧化、降血糖、抗病毒等生物活性，天然多糖还 具有毒 副作用小、疗效好等优点，现在多
2、糖已成为天然药物及保健品研发中的 重要组成部分。 本文从实验原理、 实验方法等方面对天然多糖抗氧化活性的常见 评价方法进行综述，详细介绍了化学分析法中的自由基（ABTS自由基阳离子、 DPPH自由基、超氧自由基、羟自由基）清除实验、脂质过氧化抑制实验等评价 方法；描述了以生物细胞为模型的CAA抗氧评价方法；概述了在动物体内进行 的抗氧化活性评价方法及指标， 为相关领域中抗氧化天然多糖的研究和开发提供 实验理论基础。【关键词】：天然多糖；抗氧化活性；评价方法 ；The antioxidant activity of natural polysaccharide research Name: Ca
3、o Ke Teacher:Wang Lu【 abstract 】 : Polysaccharide is a broad categories in a wide variety of plants and microorganisms in vivo biological macromolecule material, many natural polysaccharides have enhanced immune, antioxidant, fall blood sugar, anti-viral biological activity, such as natural polysacc
4、haride has poison The advantages of small side effects, good curative effect, polysaccharide has now become an important part of natural medicines and health products research and development.This article from the experiment principle and experiment method of natural polysaccharide antioxidant activ
5、ity of the common evaluation methods were reviewed, detailed introduces the chemical analysis of free radicals (ABTS radical cation, DPPH free radical, superoxide free radical, hydroxyl free radicals) removal experiment, lipid peroxidation inhibition experiment evaluation methods, such as;Describes
6、the biological cells as the model of CAA antioxidant evaluation method;Outlined in animals on antioxidant activity evaluation methods and indicators, for oxidation of natural polysaccharides in related areas to provide theoretical basis for research and development. 【key words 】 : Natural polysaccha
7、rides； antioxidant activity；evaluation methodology 1.天然多糖的抗氧化活性许多天然多糖对各种活性氧( Reactive oxygen species，ROS ) 具有清除作 用，能减少脂质过氧化产物丙二醛(MDA) 的生成量，提高抗氧化酶活性 (超氧化物 歧化酶 SOD 、谷胱甘肽过氧化物酶GSH Px等)，表现出多种途经的抗氧化作 用多糖具有广泛的生物活性，而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、抑肿瘤、降血 脂、降血糖的作用机制之一1，近年来国内外已将抗氧化检测用于抗衰老等保健 食品的评价2 ，3 研究表明，多糖具有清除 ROS 的抗氧化作用， 其
8、可能的作用机理包括： 多 糖可以通过捕捉脂质过氧化链式反应中产生的ROS ，从而减少脂质过氧化反应链 长度、阻断或减缓脂质过氧化的进行，达到对 ROS 的直接清除作用； 通过与产 生 ROS 所必需的金属离子发生络合作用，对ROS 起间接清除作用多糖环上的 OH可与产生 OH ?等所必需的金属离子 ( 如 Fe2+、Cu2+ 等) 络合，使其不能产生启 动脂质过氧化的 OH ?或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化物，从而抑制 ROS 的产生；多糖可通过提高SOD 、GSH Px等抗氧化酶的活性，从而发挥抗 氧化的作用2. 国内外研究开发现状和发展趋势2.1 国内外研究状况多糖作为药物进行研究
9、始于上个世纪40 年代，50 年代对真菌多糖抗癌效果 的发现使人们开始了多糖的系列化研究。许多研究表明多糖与免疫功能的调节、 细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系， 具有能量储存、 结构支持、 防御功能和抗原决定性等多方面的生物功能。最近又 提出了细胞表面糖分子参与细胞一细胞特异性识别的假说，发现多糖能控制细胞 的分裂和分化、调节细胞的生长和衰老， 其糖链在分子生物学中具有决定性作用。 由于组成多糖的单糖基种类繁多(目前已知的单糖有200 多种) ， 而且糖基可在多 个羟基上以两种可能的键型相互连接( 氨基酸和核苷酸只有一种连接方式)， 因此 它能以最小的结构单
10、元承载最大的生物信息量。此外，多糖在食品工业、 发酵工 业、石油工业上也有着广泛的应用。 所以近年来多糖成为天然药物研究的一个热 点，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用的研究等方面，人 们做了大量的工作。发达国家对多糖生物学的研究也都给予高度的重视。 现在多糖已成为天然药物及保健品研发中的重要组成部分，当今世界排名前 十大制药公司中的九大公司都有糖类药物研发。根据Thomson Pharma数据库目 前基于糖的上市药物世界上至少有21 种，现注册正在进行临床前和临床研发的 聚糖（寡糖和多糖）类药物有137 种，分布在 63 个国家和地区。我国十分重视 糖类药物的开发，国家科技部
11、亦把“糖生物学与重大疾病发生发展的机制研究” 列入了未来十年对生物经济引领作用的重大生命科学的应用基础研究课题题目。 我国近年来对大量植物来源的多糖，如黄芪多糖、 牛膝多糖、 猪苓多糖等进 行了研究， 相继报道了这些多糖及糖缀合物具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖等多 方面的药理作用， 有的已在临床应用， 为创制新药迈出了坚实的一步。但从总体 上来说由于我国中医药现代化、 国际化水平不高， 目前仍远远落后于发达国家对 多糖产品的研究开发水平。2.2 项目背景和重要意义2.2.1 项目背景近年来，高等植物、藻类及真菌等来源的多糖已成为天然活性产物的一个重 要类型，已发现多种多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗
12、凝血、降血糖和抗病毒等活 性。在研究多糖的生物活性过程中发现，多糖的抗氧化性与多糖的抗肿瘤、抗衰 老、抗感染、抗辐射等活性作用密切相关。由于多糖来源广且细胞毒性较低，毒 副作用小，因此对植物多糖的抗氧化活性研究已成为医药界的热门领域。2.2.2 重要意义天然多糖按照来源主要分为微生物多糖( 真菌与细菌多糖 ) 、 动物多糖和植物 多糖，其中的植物多糖包括低等植物多糖( 藻类为主 )和高等植物多糖据报道， 现已从天然产物中分离出300 多种多糖类化合物， 包括近 100种植物多糖 由于 植物多糖来源广泛， 应用于生物体的毒副作用小， 对植物多糖的抗氧化活性研究 已成为食品、医药、保健领域的热门课
13、题1 ，4，5，6。 在天然多糖抗氧化剂的研究中， 通过抗氧化活性评价， 筛选出有益人体健康 的化合物，是经典的研究思路7。整个研究中，对天然多糖抗氧化活性的评价是 核心和基础， 对后续研究有重要的指导意义。不同评价方法的实验原理、 适用范 围各不相同， 所得结果也有差异。 要准确全面地考察天然多糖的抗氧化活性，需 同时采用多种评价方法。 本文对天然多糖抗氧化活性常见评价方法的原理、体系 及优缺点进行归纳总结， 以期为相关领域的研究人员进行快速、准确的实验测试 提供参考。3. 体外抗氧化活性化学评价方法3.1 自由基清除方法自由基具有极强的氧化反应能力， 能通过氧化作用来攻击其所遇到的任何分
14、子，使机体内的大分子物质产生过氧化反应，从而引起机体不可逆损伤8，因此 评价天然多糖成分的清除自由基能力是评价其抗氧化活性的一个重要方面。31.1DPPH 清除自由基法实验原理： DPPH （1,1-diphenyl-2-picrylhydrazine，1,1- 二苯基 -2- 三硝 基苯肼）4是一种在氮氮连接键上含有不对称价电子的氮族自由基，它能稳定存 在，于 517 nm处有最大吸收值，易与具有氢键供体的化合物发生电子转移反应9。DPPH 自由基清除实验中，受试物给出的氢原子与DPPH 自由基结合，使反应 溶液的吸光度发生变化， 通过比较实验组与空白组溶液吸光度的变化评价受试物 的抗氧化活
15、性10。此方法最早由 Blois 提出11，后经大量实验改进， 已成为评价 天然多糖抗氧化成分抗氧化活性的一种常用评价方法12。但是 DPPH 方法能与任 何提供电子的化合物进行反应，所以，该方法并不能全面评价抗氧化能力。 实验方法：以 95% 的乙醇为溶剂配制浓度为0.1mmol/L 的 DPPH 自由基溶液， 此溶液需现配现用。取2.0 mL 不同浓度的受试物溶液同2.0mLDPPH 溶液混合， 25避光孵育 30 min ，于 517 nm 处测定反应溶液的吸光度，95% 乙醇做空白对 照13。计算方法如式：% =-%DPPH实验组吸光度自由基清除度（）（ 1） 100空白组吸光度2.1
16、.2. ABTS 自由基阳离子清除法实验原理： ABTS2,2-azinobis-3-ethylbenzthiazoline-6- sulphonate， 2,2-联氮- 二(3- 乙基-苯并噻唑 -6- 磺酸) 二铵盐 自由基阳离子清除实验是根据 不同浓度受试物对 ABTS 自由基阳离子溶液吸光度的影响测定中草药成分对ABTS 自由基阳离子的清除能力， 该方法最早由 Miller提出14，经 Re等15改进后被广 泛用于中草药抗氧化成分抗氧化活性的测试。在Trolox （维生素 E 的水溶性类 似物）被当作标准物用于实验测试时，此方法又称为TEAC （trolox equivalent antioxidant capacity）法14，实验中， ABTS在氧化剂的过氧化作用下形成一 种亚稳态的自由基阳离子， 该物质易溶于水和酸性乙醇溶液， 于 415 nm 、 6
