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1、DNA 聚合酶连锁反应DNA 电泳分析DNA 聚合酶连锁反应目的：聚合酶连锁反应 (polymerase chain reaction, PCR) 能短时间增殖、放大特定的DNA 片段，而使得原先可能才只有几个pg 的 DNA 增加至 mg，以利于其它实验 的进行。原理：(1)变性反应 (denaturation),使 DNA的两股分离。(2)缓冷配对反应 (annealing)，使引子与目标 DNA配对。(3)延长反应 (extension)，合成新的 DNA股。每一个循环操作可使DNA的量添加一倍，若重复操作多次，以数学公式计算，DNA增加的量将会是2n，n 是代表重复操作的次数。在理想的
2、聚合酵素链锁反应条件下，DNA是以几何级数增加。 理论上，一个 DNA分子若重复操作PCR 25次，那么 DNA的分子数将会扩增到33554432个分子。这个 DNA的量已足够在Agarose凝胶电泳中观察到。试剂、器材、仪器：(1)10x PCR buffer 成分：500mM KCl 、100mM Tris-HCl 、pH8.8、15mM MgCl2、1% TritonX-100 10 1 Taq DN聚合酶需要有 Mg2+( MgCl2)才能进行反应；但是Mg2+会和带负电的template、primer 和 dNTP结合，加强双股 DNA的键结。所以 Mg2+的浓度会影响 PCR的效率
3、和特异性， Mg2+过低 PCR产物会减少，此外 Mg2+解冻时会有沉淀产生。(2)dNTP 成分： dATP 、dCTP 、dGTD 、dTTP各 1.25mM 16 1 dNTP会和 Mg2+结合，所以过量 dNTP会影响 Mg2+浓度。过多的 dNTP也会增加 Taq的错误率和抑制其活性。此外当某一种dNTP的浓度较其它三种低时也会增加错误率。(3)Primers 是一小段单链 DNA或 RNA ，作为 DNA复制的起始点，存在于自然中生物的DNA复制(RNA引子)和聚合酶链锁反应 (PCR) 中人工合成的引子 (通常为 DNA引子)。(4)Taq DNA polymerase 从热泉中
4、的嗜热性细菌(Thermus aquaticus)所分离出来的耐高温DNA合成酵素，每秒大约合成 150 个核甘酸。(5)dH2O 灭菌水。(6)PCR管为了使加热均匀且快速， 所以 PCR专用管都是薄壁的。 使用一般微量管取代， 在时间控制上会有差异。常用的PCR管有 0.2mL与 0.5mL两种体积； 0.2mL 管各家厂商都只有作薄壁的， 但 0.5mL管有分一般与 PCR用，使用前需注意。 不过现在用 0.5 管的 PCR仪越来越少了；新机种都是用0.2 管，甚至 0.1 半量管或 384 孔盘。(7)PCR仪器将 PCR步骤自动化的仪器步骤：1.将试剂滴入 PCR管混合均匀2.将 P
5、CR管制入 PCR仪器3.设定反应条件，反应完毕即为所求DNA 电泳分析目的：用电泳的方式来测量样品DNA 的纯度及分子量大小，以利于其它实验的进行。原理：DNA电泳主要是利用： 1.正负电场2.DNA本身带负电3.电泳胶内部形成各种大小不同的孔洞DNA是高度负电荷的聚分子， 且负电荷是均匀分布于骨架的磷酸根上，因此不论长短， DNA的负电密度 (即单位质量带有的负电荷数目)是相同的，因此在电场中感受的引力就相同(差异不大 )。所以电泳DNA并不是依分子的电荷差异而分离，而是依分子大小、构形 差异而分离。一般而言，片段小的DNA因为可以穿过较小的孔隙，所以泳动速度较快，而大片段 DNA只能通过
6、大孔洞，所以速度较慢；分子的形状也会影响电泳的速率，一般而言，速率大小为：超螺旋环型线型。此外，电泳DNA时，电压的强度、胶体的浓度、及缓冲剂的种类都会影响移动的快慢。试剂、器材、仪器：(1)电泳用染剂功能如问题二所述(2)1% agarose gel agarose gel 的介质孔隙较大，polyacrylamide gel 的孔隙较小。所以分离大分子 DNA时，会依照有否连接载体、 是否切割完全、 样品中 DNA 大致的分子量等调配适当比例的 agarose ，一般 0.8% agarose 适合区分 0.510 Kb DNA。若 DNA size更大则须调降agarose 的浓度比例(
7、0.3%) ；若分离的 DNA 较小则需升高 agarose 的浓度 (2%)。其实 DNA 的分离不尽然一定是agarose ，例如操作DNA sequencing时，为了更细微的比较，会使用olyacrylamide gel 。(3)Sybre Green 能嵌入 DNA 碱基中，经 UV 光照射能放出可见光(4)TAE电泳缓冲溶液做为缓冲溶液(5)DNA MARKER做为分子量的对照组(6)电泳槽(7)数字影像系统(8)微波炉步骤 : 1.将 TAE 与 agarose 依适当比例混合加热。2.将 1 之混合液倒入 agarose 制备槽并去除气泡、杂质。3.将 agarose gel
8、加入电泳槽，并加入TAE 覆盖之。4.将 DNA 与 loading buffer混合，加入 agarose gel 孔洞。5.调整适当电压开始电泳。6.电泳完成后将 agarose gel 取出浸泡至 Sybre Green 中 30 分钟。7.以数字影像系统观测，纪录之。问题一： DNA 电泳后卫何出现2 条蓝色，深蓝色与浅蓝分别由哪项化学物质所呈色？答: 深蓝： bromophenol Blue (溴酚蓝 ) 浅蓝： Xylene cyanol FF ( 二甲苯蓝 ) 问题二 : DNA Sample 加入 6X DNA Loading buffer的目的 ? 答: (1).将 DNA染色方便观察。(2).使样品密度增加，以确保DNA沉入样品洞内。(3).防止 DNA被降解。问题三 :请附上DNA 电泳图，并标示自己组别， 如果不符合期望请分析可能原因。答:
