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1、硬骨鱼的干扰素系统Abstract 干扰素（ IFNs）是一类分泌蛋白，它可以诱导脊椎动物的细胞进入抗病毒状态。在哺乳动物，按照干扰素的基因结构、 蛋白结构和功能特点，干扰素可以分为三个族：I型干扰素， 型干扰素和 干扰素（IFN-s） 。I型干扰素包括 IFN- 和IFN- ，编码它们的基因不含内含子，I型干扰素是机体抗病毒感染的第一道防线。 人的 IFN- s有与 I型干扰素相似的生物学特性，但编码它们的基因含有内含子。型干扰素即IFN-，是由 Th1细胞在有丝分裂原和抗原刺激下产生的细胞因子，IFN- 在细胞介导的天然免疫中起关键作用。类似哺乳动物干扰素结构和功能的蛋白已经从Atlant
2、ic salmon, channel catfish, pufferfish, and zebrafish得到克隆。硬骨鱼至少有两类I型干扰素，序列进化树分析显示，鱼类的I型干扰素是从禽类的I型干扰素和哺乳类的 IFN- 、IFN- 和IFN- 分化出来的一个分枝。有趣的是，鱼类的IFNs内含子 / 外显子的结构类似于人 IFN- s，而其序列相似性更接近IFN- 。目前，几种鱼的IFN- 基因被克隆出来，其基因结构与哺乳类 IFN- 相似。I型干扰素的抗病毒作用是通过结合细胞上的IFN- / - 受体，通过 JAK-STAT信号传导途径启动Mx和其它抗病毒蛋白的表达。Pufferfish 等
3、多种鱼的 IFN受体已经被鉴定。同时也证实了干扰素调节因子（IRFs）及JAK-STAT成员在鱼类中的存在。Mx 蛋白的活性也得到广泛证实。1Introduction 干扰素是诱导细胞进入抗病毒状态的一种分泌蛋白，它在脊椎动物抗病毒感染中起重要的防御作用1 。干扰素最早是由Isaacs 和Lindenmann两人发现和命名2 ，他们在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的干扰现象时才发现感染病毒的细胞能分泌一种抗病毒蛋白，这种抗病毒蛋白能激活邻近细胞抗病毒状态的产生、 抑制多种同源和异源病毒的感染。第一个被克隆到的干扰素是1980年来自人的 IFN- 和IFN- 3 ，4 ，但直到 1994年，鸡的
4、干扰素才被克隆5 。鱼类干扰素活性是1965年被鉴定出来的，病毒或双链RNA（dsRNA ）刺激后的鱼类细胞和器官也可以分泌一种抗病毒物质6-19。然而，直到2003年，第一个鱼类的干扰素才被克隆出来20-22。两类干扰素 （ I型干扰素和型干扰素）可以按照基因结构、蛋白结构和功能特点得到区分1 ， 23， 24 。I型干扰素包括 IFN- / 两个族，病毒可以诱导诸多细胞产生；型干扰素即IFN- ，是由自然杀伤细胞（NK cells ）和 T淋巴细胞在白介素12（IL-12 ） 、白介素 18（IL-18 ） 、有丝分裂原和抗原的刺激下产生1 ，25 。 I型干扰素也可以通过在酸性条件（PH
5、2）下的稳定性而与IFN- 区分开来 26 。两类干扰素在结构上都具有典型的螺旋结构，但其三维结构和结合的受体不同。本文是基于对高等脊椎动物IFN系统的认识结合现有的鱼类干扰素的研究而作的综述。2 高等脊椎动的 I型干扰素I型干扰素是脊椎动物抗病毒的第一道防线。这一事实是通过IFN- / 受体敲除的小鼠对诸多病毒易感的实验而等到证实的27 。 IFN- / 的抗病毒作用是被两类信号通路所介导的（图1）1 ，28 。在宿主细胞识别了病毒复制过程中的dsRNA 后，IFN- / 迅速被诱导 29 ，30 。病毒感染的细胞分泌干扰素后，干扰素随血流输送到全身各部位，启动各类细胞的抗病毒机制。IFN-
6、 / 是通过与分布于所有有核细胞表面相应受体结合而发挥作用的。这种结合JAK-STAT通路触发信号传导从而导致几百种基因的转录，其中包括 dsRNA 依赖的蛋白激酶R(PKR) 、2 ,5 -oligoadenylate synthetase（OAS ） 、RNA-specific adenosine deaminase (ADAR) 和GTP-ase Mx 蛋白1 。 哺乳动物的 I型干扰素是由至少八个subclasses 组成的多基因家族，如：IFN- 、IFN-、IFN- 、IFN- 、IFN- 、IFN- 、IFN- 和limitin23 。IFNIs 的特点是编码它们的基因没有内含子
7、，与它们结合的受体是同样的异源二聚体（IFNAR-1 和IFNAR-2 的亚单位）。人的 I型干扰素是由超过20个成簇的基因编码于九号染色体上的，其中有13个功能性的 IFN- 、1个IFN-、1个IFN- 、1个IFN- 和1个 IFN- 基因 24 。最近，在人类的第 19号染色体上发现了成簇的一类新的I型干扰素样基因：IFN- 1、IFN- 2和IFN- 332 ，33 。这些细胞因子由5个外显子编码， 结合不同于 IFN- / 受体的另一类受体，并且拥有与 IFN- / 不同的抗病毒活性。病毒感染后，尽管IFN- / 大量产生于血液中的一种树突状细胞，然而，哺乳动物的大多数细胞都有产生
8、 IFN- / 的能力 31 。 IFN- 产生于反刍动物的trophoectoderm中， 尤其在早期妊娠中重要35 。 IFN- 产生于猪的胚胎滋养层细胞中36 。鸡有两类不同的I型干扰素，一种是一个拥有至少10个成员的家族，另一个只有单个基因编码5，37， 38。基于序列对比，鸡的两类I型干扰素不能归属到IFN-和IFN- 。图：如图所示是 I 型干扰素 IFN-为例的对 2-step 信号通路的详解， IFN-是人类细胞病毒感染后最先分泌的一种干扰素。病毒感染的细胞通过Toll-like受体 3（未标出）识别病毒dsRNA ，之后出发干扰素调节因子3（IRF-3 ）的激活以及 NF B
9、入核，从而结合 IFN-启动子的特异位点。同时，磷酸化的IRF-3 同与之转录共激活的CBP/p300相互作用，激活 IFN-的转录。分泌出的 IFN-与诸多细胞表面的IFN-/受体结合， 触发 TYK2 和JAK1酶活性的活化， 这一活化进一步磷酸化转录因子STAT1和STAT2 。激活的 STATs 进入到细胞核中与IRF-9 形成二聚体，此二聚体进一步结合到干扰素刺激基因（ISGs）的干扰素刺激反应元件上（ ISRE）。最终， ISGs的转录诱导多种抗病毒蛋白的产生，如Mx,PKR,OAS 等。尽管 I 型干扰素在大小（143-172个氨基酸）和二硫键的数目（0-2 个）上有差异。但其晶
10、体结构显示它们有共同的三位结构和类似的 5个螺旋。除了诱导细胞进入抗病毒状态，哺乳动物的IFN-/在对先天和后天的免疫中也有多重的调节作用，如它们可以增加NK 细胞杀伤病毒感染的细胞43 ，增加 MHC 的表达以促进抗原呈递反应44 ，促进 T细胞的存活并刺激树突状细胞的成熟和分化，介导病毒感染细胞的凋亡1 并抑制细胞增生47 。3 鱼的I 型干扰素干扰素基因已经从几种鱼中克隆出来：zebrafish, Atlantic salmon, the Japanese pufferfish Takifugu rubripes (Fugu), the spotted green pufferfish
11、Tetraodon nigrovirides, and channel catfish20-22 ，48。仅仅有一种功能基因分别从zebrafish和pufferfish 中得到克隆。 然而， 基因芯片的测序分析显示zebrafish和Fugu在同一条染色体上存在两类I型干扰素 49 。对Atlantic salmon 的研究显示， 它有至少两个功能基因（Sasa IFN-1 and Sasa IFN-2）,这可能是由 salmonids在进化过程中发生的四倍体时间导致50 。这两个 IFN 基因是不同基因组上的BAC克隆，其中一个含有几种IFN假基因（ ?） .无独有偶，这种存在于Atlan
12、tic salmon 基因组中的 additional functional IFN genes 的情况也可以在其它鱼类的研究中得到验证22 ， Southern blot 研究表明channel catfish的基因组上可能有2-3个 IFN基因。不同于鸟类和哺乳类的一点是鱼类I型IFN基因都含有 5个外显子和 4个内含子，鸟类 和哺乳类的 I型IFN基因不含内含子 21，22。有趣的是， I型 IFN有与IL-10和IFN- 族类相似 的内含子 /外显子结构（ fig.2），这可能表明， I型IFN基因与 IL-10 和IFN- genes源于共同的 始祖。 翻译出的鱼类 IFN前体蛋白有
13、 175-185个氨基酸和一段 22-23个氨基酸的信号肽。 鱼类的信 号肽序列仅仅在鱼类中有某种序列同源性而同高等脊椎动物的IFN信号没有相似性 22 。 前体 蛋白的结构比较如 Table 1. 显示。鱼类的 IFNs在大小上与哺乳动物的相似（含有152-164个氨 基酸，分子量为 18-18kDa），成熟的Atlantic salmon IFN 是目前发现的最短的。克隆到的channel catfish似乎缺少信号序列和成熟蛋白的头几个氨基酸。与pufferfish 具有酸性的等电点不同的是，salmon、catfish和zebrafish都含有偏碱性的等电点。高等脊椎动物的I型IFN蛋
14、白之间也有挺大的差别。然而，除了斑马鱼的IFN ，所有鱼类的 IFNs 都有潜在的糖基化位点。在其它脊椎动物中，也有类似的不同程度的糖基化，如大多数的 IFN- 没有糖基化现象，鼠的 IFN- 有 3个糖基化位点， 鸡的 IFNs有四个糖基化位点。看来， IFNs的糖基化在进化中并不保守。Salmon、zebrafish和pufferfish 的IFN 蛋白含有 2个半胱氨酸，catfish则有三个。Fig.2.鱼类 IFN 和人IFN 、IL-10 基因结构的比较。数字代表核苷酸数目。实心和空心的Box分别代表未翻译区域和外显子编码区。实线代表内含子，其长度占外显子的1/5。Table 1
15、鱼类成熟干扰素的物理性质数据来源于已发表的文献20-22,48及利用软件对 GenBank中序列的对比。 Atlantic salmon 的序列用的是 Sasa IFN-1。其它鱼类的蛋白序列是通过分析其信号肽（SignalP program (http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ ).）及前体序列对比而获得。它们的分子量和等电点是用DNAstar 软件包分析而得到的。Fig.3 图示为用 ClustalX软件包对鱼类、哺乳类和鸟类的I型干扰素进行比对的结果。比对的结果也给出了序列间氨基酸的相似度（identity ）（ Table 2）。Atlanti
16、c salmon, channel catfish 和 zebrafish 的序列相似度在43-46%，而 pufferfish IFNs 与其它鱼类的相似度在23-35%，salmon IFNs 的该值为 97%。一般地， 鱼IFNs 序列的同源性同鼠的IFN- 4、人的 IFN- 2b和人的 IFN- 1的氨基酸序列较接近 27-30% 。 鱼IFNs的氨基酸序列与人和鼠的IFN-、 鸡IFNs 的和人的 IFN- 的序列相似度在13-23%。Fig.3 不同物种间序列的比较。由ClustlX 计算所得。文中黑色方块为序列一致性较好之氨基酸残基。序列中标出了物种间I型IFN 一致性较好的氨基酸残基，这些残基可能对于蛋白质的稳定性和活性有重要
