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1、PicoGreen 荧光法定量生物制品 DNA 残留在 Modulus 多功能检测 仪上的应用 1应用说明 疫苗是现代疾病预防中常用的控制方式。如今许多疫苗是细胞培养疫苗，比如重组乙肝 疫苗、 狂犬病疫苗等大多数疫苗都采用细胞培养的方法生产。 其中， 疫苗的纯化是关键问题， 我们需要尽可能的去除宿主细胞 DNA 和宿主蛋白。假若宿主细胞的 DNA 和蛋白同疫苗一 起注入人体将会产生不可预料的后果。 常规的 DNA 含量的检测方法是在 260nm（A260）处测其吸光值。这种方法的主要缺点 是核苷酸、单链核酸和蛋白质对信号的影响很大，并且还会受到核酸制备过程中污染物的干 扰，无法区分 DNA 和
2、 RNA，而且这种方法不灵敏（ 5 g/mLdsDNA溶液 A260=0.1） 。 在 2010 年版中国药典的征求意见稿中，针对生物制品的 DNA 残留检测，药典提供 了两种检测方法。其中的 PicoGreen定量检测方法简单、方便，被多家生物制品厂所选择， 成为生物制品残留 DNA 检测的标准。 Modulus TM 单管型多功能检测仪是 Turner Biosystems 公司的一款产品，具有发光、荧光 和吸收光检测功能。使用 Modulus TM 单管型多功能检测仪，可以通过 PicoGreen 来精确定量 dsDNA。如果使用微量适配器，可以将检测体积减少到 100ul 以下，节约样
3、品的同时也节约 了染料的成本。 2所需器材 Modulus TM 单管型多功能检测仪（9200-003） 微量适配器（9200-928） 微量比色皿 PicoGreen 试剂 3 试验方案 3.1 试剂准备 PicoGreen 是以 1mL的浓缩液形式保存在无水的 DMSO（二甲基亚砜）中。实验当天， 配制 2 PicoGreen 试剂的工作溶液，用 1TE 按 1:200 的比例稀释浓缩液（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA， pH7.5） 。 如果要准备足够的工作溶液测定 20 个样品， 可在 20mL1x TE 中加入 100 L PicoGreen dsDNA 定量试剂。由
4、于试剂容易吸附到玻璃表面，要在塑料容 器中配制。 PicoGreen 试剂见光易降解， 所以应将配好的溶液用箔包住或放置暗处避光保存。 溶液最好在配制好数小时内使用，以保证最佳结果。 3.2 DNA 标准曲线 北京原平皓生物技术有限公司 电话：010-82888900-803 传真：010-82888716 E-mail： orderyph- W eb： www.yph- 3.2.1 标准品工作液的配制： Sigama 小牛胸腺嘧啶 DNA 干粉 （货号： D4522-1MG） 1mg （Tris， Nacl 等浓度已成标准体系），加入 1mL 双蒸水，配制成 1mgmL 的标准品工作液； 3
5、.2.2 标准品工作液稀释： （1）母液稀释：取 10ul（1mgmL）标准品工作液加入到 990ul TE 溶液中，浓度稀释成 10ugmL，取 10ul（10ugmL）标准品工作液加入到 990ul TE溶液中，浓度稀释成 100ngmL； （2）倍比稀释：取 800ul （100ngmL）的标准品工作液加入到 200ul TE溶液中，浓度达 到 80ngmL（药典规定：荧光染色方法 DNA 含量在 1.25-80 ng/mL范围线性较好, 该 法 DNA 检出限为 0.3 ng/ml） ，取 500ul （80ngmL）的标准品工作液加入到 500ul TE 溶液中，浓度稀释到 40ng
6、mL；依次倍比稀释，配成 20ng/ml、10ng/ml、5.0ng/ml、 2.5ng/ml、1.25ng/ml、0.625ng/ml 的标准品溶液； 3.2.3 标准曲线的制备：倍比稀释后的各梯度标准品溶液和染料工作液各取 100ul 混匀，避光 室温放置 5min。 2DNA 溶液浓度 （ng/mL） 2DNA溶液的体积 （mL） 2PicoGreen 溶液的 体积（mL） PicoGreen 试剂测定中 DNA 的终浓度 (ng/mL) 80 0.5 0.5 40 40 0.5 0.5 20 20 0.5 0.5 10 10 0.5 0.5 5 5 0.5 0.5 2.5 2.5 0.
7、5 0.5 1.25 1.25 0.5 0.5 0.625 0.625 0.5 0.5 0.3125 0 0.5 0.5 空白 表 1：标准曲线的溶液制备 3.2.4 使用 Modulus TM 单管型多功能检测仪的 Blue荧光模块检测样品的荧光值：将混合后的 溶液加入微量比色皿，确信不要在样品中引入气泡，轻轻地弹微量检测皿的外部，可以驱散 气泡。 以 1TE缓冲液为 blank， 测定样品和空白对照的荧光值； 用标准品溶液的浓度 （ng/ml） 对应的荧光强度作直线回归，制备标准曲线（图 1、图 2） ； 2DNA 溶液浓度 （ng/mL） PicoGreen 试剂测定中 DNA 的 终浓
8、度 (ng/mL) 荧光值 80 40 3260.19 40 20 1774.12 20 10 911.85 10 5 537.89 5 2.5 331.99 2.5 1.25 219.69 1.25 0.625 179.06 0.625 0.3125 156.82 空白 空白 115.51 表 2：标准曲线样品检测值 北京原平皓生物技术有限公司 电话：010-82888900-803 传真：010-82888716 E-mail： orderyph- W eb： www.yph- 北京原平皓生物技术有限公司 电话：010-82888900-803 传真：010-82888716 E-mail
9、： orderyph- W eb： www.yph- 标准曲线图 y = 39.458x + 133.17 R 2= 0.9994 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 02 04 06 08 0 浓度(ng/ml) 荧光值 1 0 0图 1：标准曲线 标准曲线图 y = 41.616x + 122.58 R 2= 0.9931 0 50 100 150 200 250 300 350 0246 浓度（ng/ml） 荧光值图 2：图 1 左下角低浓度部分的标准曲线放大 4 样品分析 在每个样品中加入等体积的 2PicoGreen 工作溶液（ 3.1 节准备）
10、，充分混匀，避光于 室温下孵育 5 分钟。将孵育好的溶液加入微量比色皿，使用 Modulus TM 单管型多功能检测仪 检测其荧光值。将样品溶液的荧光强度代入回归方程，求出样品的残余 DNA 含量（ng/ml） 。 北京原平皓生物技术有限公司 电话：010-82888900-803 传真：010-82888716 E-mail： orderyph- W eb： www.yph- 5 结果分析 在 2010 年中国药典 （征求意见稿）中提出，PicoGreen 定量 DNA 的方法检出限约 0.3ng/ml，DNA含量在 1.25-80 ng/mL范围时线性较好。 在此次制备的标准曲线中，在 0
11、.625-80ng/ml 保持了极好的线形（R 2 =0.9994） ，最低标准 曲线点达到了 0.3125ng/ml，并且有进一步稀释检测的可能。这表明 Modulus TM 单管型多功 能检测仪可以完全满足药典规定的 PicoGreen 检测试验，并且可以进一步实现更高的灵敏度 需求。 6 关于 Modulus TM 单管型多功能检测仪 Modulus TM 单管型多功能检测仪是 Turner Biosystems 公司生产的一款单管型多功能检测 仪，它具有生物与化学发光检测、荧光检测和光吸收检测三个功能。Modulus TM 单管型多功 能检测仪采用模块化设计, 可根据实验的需求, 选用相应的检测模块, 来完成生物与化学发 光、荧光或光吸收检测.
