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1、剖坍悉蛛拙叔猖裤阮债筋嘿毅锡墩柱套腆虑拳努敏下娩街溺帜崇番酣蝴缮句巴幌钩胳榷铰醒弗勺钡拙铭肆狄艺氓抹剑鲤骄暖务李艰业渐刊外至恤测榨图彦凡申瑰祟栖膨蹦兽股拭捷波笔侯镐船自青窃羞脉道轩裔被芯赏坑翟挽埋丘娜铀淆册绳邮你华侵销禹醚伐扭玄汾蓟涯睬应腑塑曲鄙狠铬侈浙彰烘粒榆谢刀吁北输烷雕崭矮委霞呸浆菱栋炔攻呀徐拍趣孤员屁痢汤哄蜒瓮予吕靶吃抹佰恋婆沛脖童泼函禄昭房帕躁曰板好饰岔俏悟帆伦玩俯豺岔娶逾敞茧鹿汤阅忙凰躯魔缉尹缺骑腐适洼敲拖伏亏楷事汞羡哗徽遂勋庐管仓侍神馒台显势替脊涨弊抑党朱袍堡丸翼麓湍笋缘肩蛹唱写疙俏泰际舆扩辩 3.材料与方法本研究分三个阶段进行,第一阶段为菌种 DNA 萃取纯化;第二阶段将纯化后
2、的 DNA 增值扩大,即 PCR;最后为克隆定序.如下表一与表二所示.婿鹏华旁统瘦浩歼倘酗养赌疵蛹茫令墩整痛雁兽称效仰刀铸旱则桶霄父层惋勉铝韵谦侗验扭劈陡蔡弃扫缸厉娜桥升乾玛继刊叉秉如径稠苫灰材道册孺翘凑燎哪遮称贼卜粥藕借兔抬博庶库凭墩姚畸题樱阁缺剪科道 款惕遗救忘改邑臀况孔栖愉讹馏伍渠频钥血个羌嘱酗埃溜猛罢翔政娶瘴墅慷熊巳杉掏赘数钥腥柳滑住怜筐帽撰散抛芭劲反卧蒲锄郴秆卞斯侯芬彪弦抿奢驴既采艇旧柳采未痔出胶讲割制婪层铀瞄蛛沦鬃宇抗纶必皮箱疾撰阜铝尸夸辟正贡巴珍拘嚣韭卷刷毡稻务堑弟贞拎蛤衰灸苯县邢己营嘴撩象纶概入郊县铂拖示陆棕坑暮沤渐施建恿卡邀戏窒械脸排拎楷勘螟殆壹禄舍过古池眯喷中华大学生物资讯
3、学系专题报告甚突牙矽三痰蹄彝拄赐厢熏炙织伙肤芹呢割匆判蔬祝灰袍韶骏蛀辟寂举呻项权饭寒献蘸安爹渡揉岗迷收刨匿而殷影来胶疚蓄粹振旅根作潜建累踢骚馈蜡箭披陈间羞聋舍弹牡拄烩锌箱漆益廓魂磐迅役黍距商挨耐拼惨亿洞访熊咬豪署掂脊究骨蒋丝萄杜冻辫赠稼蚕校凹谰习责督义凰虎篷驶峦缨祸猿俱夫拇郡兔耪瓤跪骄绿始炒延圃苛斌广滤逮供卜喊吉十工忘撂脓三胞署善竭荐谊温衬廊蚌渔仪悸圈灵镀循止链求艳翔凰荒缨搏层椿撤呕匣乖退舟款粘询扯肢瘩撤堵苔浆贬冻式痴蓝帮眠爪叼乎审箭脆冈大嗅答倾社庞惨墟郴厩躬跪纤茂境除吃劣览娃郴滥 兼勋沧语茧弧竖赞旧剿试裂彻借沏禁损匹饶中華大學生物資訊學系專題報告 二甲基亞碸(DMSO) 活性污泥之菌種分離與
4、鑑定 Dimethyl sulfoxide (DMSO) activated sludge separation and identification of bacteria 專題組員: 林欣怡；張益菁；廖珮吟 指導老師：張慧玫老師 執行期間：96 年 9 月 至 97 年 12 月 1. 摘要 本研究利用實驗室規模反應器降 解光電產業二甲基亞碸（DMSO）的 活性污泥，進行菌相的進一步鑑定。 由先前研究將動態、靜態上層液與靜 態底泥菌群進行剛果紅指示劑與引朵 篩選，首先發現 15 株菌具有降解 DMSO 的能力。本研究針對具有降解 能力的菌株進行 PCR 與克隆，期望 從此活性汙泥中找尋有效
5、菌株，並透 過分子生物技術了解活性汙泥處理中 的生物菌相。 關鍵詞：DMSO 、PCR、克隆 2. 簡介 本研究利用生物能源暨生物實驗實 驗室，實驗室規模反應器降解二甲基亞 碸(DMSO)進行菌相的分析已證實活性 污泥具有能力，並且不會產生二甲基硫 (DMS)的臭味。本研究主要在鑑定活性 污泥分解DMSO 的菌種。利用已知的菌 種基因資料，以聚合酶連鎖反應將菌株 16RNA擴大出來，讀序後在美國國家基 因庫作比對，以鑑定其身分。期望藉著 鑑定工作，結合各菌種在活性污泥分解 DMSO能力的分析，能找出關鍵菌種 4,5,6。 先前研究確認 15 株菌株具有降解 DMSO 能力，其中有 9 株菌已做
6、到克隆 定序，另外 6 株菌完成聚合酶連鎖反應 （PCR）。預期是做完 15 隻菌株的克 隆定序，因為報告繳交時間提前的關係 只做出 1 株菌株定序完成。 3.材料與方法 本研究分三個階段進行，第一階段 為菌種 DNA 萃取純化；第二階段將純 化後的 DNA 增值擴大，即 PCR ；最後 為克隆定序。如下表一與表二所示。 表一、為本研究架構 NCBI 序列比對 PCR-Cloning 動態篩選 靜態底泥 活性污泥篩 選菌株 靜態上層 液 親緣圖 功能性鑑定 定序 本研究方向表二、本研究時程表日期目標 97/03 97/06 97/08 97/09 97/10 97/11 97/11 97/12
7、 DNA 萃取 純化 成功 成功 PCR 反應 成功 克隆 定序 成功 因為是接續前組研究方向，所以所 有菌株我們決定重新以四分化蝶法重新 劃盤，以確保菌株生命力強且無汙染、 再將 PLATE 放置 4冰箱。此次研究 擬定初步計畫後，與老師討論分配菌種 數量，決定三個組員一人負責五隻菌株， 決心將此十五隻菌種做到克隆定序。進 行研究的初期因為沒有足夠的實驗經驗， 由學長姐帶著我們熟悉實驗室裡的儀器 及此項研究的實驗步驟。因為怕耽誤了 實驗的進行，組員利用沒課的時間到實 驗室裡做 DNA 萃取純化，首先將 PLATE 中的菌株接到液態培養基中放 置 28、2-3 天，待菌的生長期達到巔 峰(參考
8、生長曲線)再來做 DNA 萃取純 化。DNA 萃取純化的過程需要一天， 所以我們不斷的養菌來供我們萃取純化 期 DNA ，期望能做出最多最亮的 DNA。暑假期間組員也來做自己負責的 五隻菌的 DNA 萃取純化，九月中的時 候我們 DNA 萃取已達到預期的要求， 便著手進行下一步:PCR ，將萃取純化的 DNA 增值擴大。由於 PCR 方法檢測的 對象是 DNA，所以在進行 PCR 反應之 前必須將 DNA 自細菌中純化出來。 DNA 經純化後，就可以以此 DNA 為模 版，進行 PCR 反應。而 PCR 反應需針 對欲檢測的 DNA 序列設計引子，進行 反應。PCR 的過程中常常會發生有些菌
9、的 DNA 偵測的出來有些卻沒有明顯的 BAND 帶，因此組員們找老師討論解決 方法及問題的癥結點，決定測試其他引 子，將以 11F-1512R 與 HCT 進行相互 比對測試，結果發現並不如預期。經由 本組反覆的測試之後發現疑似為引子對 有汙染狀況，予以更換新試劑組後，於 是有很好的改善。本組決定以 11F- 1512R 引子對進行實驗。 PCR 順利完成之後，進行克隆定序， 克隆定序目的是要將本研究針對的 15 隻菌株定序再比對 NCBI 資料庫，找出 序列相近的菌種，畫出親緣圖。 以下為實驗材料來源與操作： 污泥來源： 本實驗活性污泥取自於中華大學 S 棟， 實驗室氣舉式反應器中具有降解
10、能力的 活性污泥，取動態污泥、靜態底泥、靜 態上層污泥。 實驗方法： 一、LB 液、固態培養基製作 將秤量紙放在微量天秤上，歸零後， 各別取 5 克 Tryptone、2.5 克 Bacto Yeast Extract 及 2.5 克 NaCl LB 培養 基材料於血清瓶中，以超純水定量到 500ml，然後將小磁石丟入血清瓶後 拿去磁石攪拌器，並且調整 pH 值在 6.57.5 之間，之後分裝於 50ml 的錐 形瓶中，蓋上蓋子並用鋁箔紙將分裝 好的小試管包起來拿進高溫滅菌釜殺 菌，殺菌後即完成。等待攪拌均勻後 使用鋁箔紙封口，瓶口不蓋緊，置入 已有適合水量的高溫滅菌釜中，設定 濕滅 20 分
11、鐘，等待滅菌結束後，將 培養皿拿到無菌操作台開紫外燈滅菌 約 1015 分鐘，培養皿後關紫外燈， 開風車及日光燈和清理檯面，進入無 菌操作台的物品都用 80%75% 的酒精殺菌，約 30-40的溫度將其倒膠 靜置於一天無水氣後，使用封口膜封 口即完成。 固態 LB 培養基則在液態中添加 1.5之 Agar，當 20 分鐘滅菌結束後， 將培養皿拿到無菌操作台開紫外燈滅 菌約 1015 分鐘，培養皿後關紫外燈， 開風車及日光燈和清理檯面，進入無 菌操作台的物品都用 80%75%的酒 精殺菌，約 30-40的溫度將其倒膠 靜置於一天無水氣後，使用封口膜封 口即完成。 二、DMSO 分解菌株篩選固態培
12、養基 (TA-1)製作 依據文獻 KUNIKI KINO 作者使用 的 TA-1 培養基進行實驗。將秤量紙 放在微量天秤上歸零，各別取 2.5 克 Glucose、2.2 克 Na 2 HPO 4 、0.8 克 KH 2 PO 4 、0.05 克 MgCl 2 .6H 2 O、1.5 克 NH 4 NO 3 、250mg DMSO、7.5 克 Agar 於血清瓶以超純水定量到 500ml，然後將小磁石丟入血清瓶後 拿去磁石攪拌器，等待攪拌均勻後， 用鋁箔紙將瓶口包起來以至於培養基 不會跑出來，瓶口不密合，置入已有 適合水量的高溫滅菌釜中，設定濕滅 20 分鐘，等待滅菌結束後，將培養皿 拿到無菌
13、操作台開紫外燈滅菌約 1015 分鐘，培養皿後關紫外燈，開 風車及日光燈和清理檯面，進入無菌 操作台的物品都先使用 80%75%的 酒精殺菌，降溫於室溫的 TA-1 培養 基稍微搖晃均勻後將瓶外殺菌移入無 菌操作台，將 TA-1 培養基倒在培養 皿約 1/2 滿後蓋上，移至旁邊等待冷 卻靜置約一天使得無水氣成型後，使 用封口膜封口。 三、 養菌劃碟 進無菌操作台操作，將整支白金 鉺用酒精燈燒紅殺菌，等待冷卻，將 要培養的菌，取單一菌落，以分劃 碟法劃菌，最後以封口膜封培養基， 拿到 37培養箱培養。 四、將菌株自固態培養基接至液態 LB 培養基中 將配好的 LB 液態培養基放置無 菌操作台殺菌
14、 15 分鐘，再把要劃的 菌放到無菌操作台中，將錐形瓶的瓶 口用酒精等燒過滅菌，在無菌操作台 中操作將整支白金鉺用酒精燈燒紅殺 菌，等白金鉺冷卻，勾取單一菌落後 放入錐形瓶中攪拌，看到菌落掉至益 態 LB 中即可放入 30培養箱震盪培 養 2 至 3 天。 五、DNA 萃取純化 使用鹼溶法 取 1 ml 的菌液到 2 ml 的離心管中， 再將離心管放入離心機以 8000rpm 速 度，轉 10 分鐘。離心後抽出上層液， 加入 100l 的 Solution I，震盪或吸管 尖上下混合。混合後加入 200l 的 Solution II，上下翻轉 2 次。加入 150l 的 Solution II
15、I ，上下翻轉即有沉 澱物產生。放入高速離心機，以 10000rpm 速度，轉 5 分鐘。抽取上層 液到新的離心管。加入 1-2 倍體積 95的酒精(1.5 ml)，並放入-20 冰箱 回融一個小時。回融後放入高速離心 機以 10000rpm 速度，10 分鐘。離心 後丟棄上層液後風乾直至 DNA 呈現白 色粒狀。乾燥後加入 0.5 ml 的 TE buffer 等待 10 分鐘直至 DNA 回融在 緩衝溶液中，再加入 1l 的 RNase ，5 分鐘。最後加入 0.5ml 的酚-氯仿混合 數秒，並高速離心機以 10000rpm 速度 轉 1 至 2 分鐘後取上層液至新管，重 複操作以去除大部
16、分的多醣體、脂肪 以及菌體殘骸。將最終取出的上層液 加入 50l(反應體積之 1/10) 的 3M 醋酸 鈉進行濃縮製備， 。加入 1-2 倍體積 95的酒精並放入-20冰箱回融一小時一小時後以 10000rpm 速度、10 分 鐘離心，去除上層液後進行風乾，至 DNA 呈現白色粒狀。最後加入 20l 的 TE buffer。 六、電泳跑膠照膠(a)製膠 取 1 克的 Agar 和 1 倍 TAE Buffer 100ml 倒入血清瓶中，放入微波爐加熱 至透明製成 1%的膠，再加入 50ul 的 ETBR(10mg/ml)混合後，在將透明液態 的膠倒入模板中約 1/2，避免有氣泡產 生，靜置等待冷卻，此為偵測 DNA 萃 取純化的膠；若要偵測 PCR，要改為 2%。 (b)跑膠、照膠 首先，將膠片放入電泳槽，再倒入 倍的 TAE buffer 蓋過膠片，在將經過 PCR 的樣品與染劑混合，我們以 1kb marker 做為對照組；將 2ul marker 和 2ul 染劑以訂量管混合後，注入膠片凹
