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1、华 中 科 技 大 学博 士 学 位 论 文糖 原 合 成 酶 激 酶 3 在 油 酸 诱 导 胰 岛 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 及 调 控姓 名 ： 吴 薇申 请 学 位 级 别 ： 博 士专 业 ： 儿 科 学指 导 教 师 ： 罗 小 平2011-052 3华中科技大学博士学位论文糖 原 合 成 酶 激 酶 3 在 油 酸 诱 导 胰 岛 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 及 调 控华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附 属 同 济 医 院 儿 科 ， 武 汉 430030导 师 ： 罗 小 平研 究 生 ： 吴 薇中 文 摘 要 第 一 部 分抑 制 糖 原 合 成 酶 激
2、 酶 3 活 性 对 油 酸 诱 导 胰 岛 细 胞 凋 亡 的 作 用【 背 景 】 近年来随着儿童肥胖症发病率明显升高，在世界范围内儿童肥胖已成为 一 种 新 的 流 行 病 ， 并 导 致 与 之 相 关 的 儿 童 2 型 糖 尿 病 发 病 率 增 加 。 而 儿 童 2 型 糖 尿病 的 增 多 将 严 重 影 响 全 人 类 的 健 康 状 况 ， 其 并 发 症 将 会 对 个 人 、 家 庭 和 社 会 造 成 严 重影 响 。 型 糖 尿 病 患 者 细 胞 凋 亡 是 其 重 要 的 发 病 机 制 ， 而 糖 原 合 成 酶 激 酶 （ GSK-3）被 认 为 是 一
3、些 凋 亡 信 号 途 径 的 重 要 组 成 部 分 。【 目 的 】 本 试 验 以 油 酸 （ OA） 为 凋 亡 诱 导 剂 ， 观 察 GSK-3 在 大 鼠 胰 岛 INS-1 细胞 凋 亡 中 活 性 的 改 变 ， 探 讨 在 此 凋 亡 模 型 下 GSK-3 是 否 参 与 胰 岛 细胞凋亡以及GSK-3 抑 制 剂 （ 氯 化 锂 ， LiCl） 对 细 胞 凋 亡 的 作 用 。【 方 法 】 应 用 细 胞 培 养 、 流 式 细 胞 仪 、 免 疫 印 迹 法 观 察 不 同 浓 度 OA 处 理 下 INS-1细 胞 （ 大 鼠 细 胞 系 ） 凋 亡 率 的 改
4、 变 以 及 GSK-3 磷 酸 化 程 度 的 变 化 ， 并 用 LiCl 抑 制GSK-3 的 活 性 后 再 检 测 INS-1 细 胞 凋 亡 率 的 改 变 以 及 GSK-3 磷 酸 化 程 度 的 变 化 。【 结 果 】 用 不 同 浓 度 的 OA(00.6mM)可 诱 导 INS-1 细 胞 发 生 凋 亡 ， 而 随 着 OA浓 度 增 加 ， INS-1 细 胞 凋 亡 率 亦 增 加 。 OA 浓 度 为 0.2mmol/L 时 ， INS-1 细 胞 开 始 出 现明 显 的 凋 亡 ， OA 浓 度 增 加 至 0.4mmol/L 时 ， INS-1 细 胞 出
5、 现 最 大 的 凋 亡 百 分 数 ， 但随 着 OA 浓 度 进 一 步 提 高 ， INS-1 细 胞 的 凋 亡 不 再 随 之 明 显 增 加 。 随 后 应 用 0.4mmol/LOA 处 理 INS-1 细 胞 ， GSK-3 磷 酸 化 程 度 较 正 常 组 明 显 降 低 ， 但 总 GSK-3 含 量 并 无 明1华中科技大学博士学位论文显 改 变 ， 提 示 GSK-3 活 性 明 显 升 高 。 而 加 入 不 同 浓 度 的 LiCl（ 0 36mM） 时 ， 随 着LiCl 浓 度 的 增 加 ， INS-1 细 胞 的 凋 亡 率 逐 渐 减 少 ， 在 用 2
6、4mmol/L 的 LiCl 对 GSK-3 的活 性 进 行 抑 制 后 ， INS-1 细 胞 的 凋 亡 率 明 显 下 降 。【 结 论 】 0.4mmol/L 的 OA 可 通 过 激 活 GSK-3 来 诱 导 胰 岛 细 胞 （ INS-1） 发 生最 大 程 度 凋 亡 ， 而 加 入 LiCl 可 通 过 抑 制 GSK-3 活 性 在 一 定 的 程 度 上 减 少 因 OA 诱 导的 INS-1 细 胞 凋 亡 。 说 明 GSK-3 在 OA 诱 导 胰 岛 INS-1 细 胞 的 凋 亡 中 发 挥 重 要 作 用 ，而 通 过 抑 制 GSK-3 的 活 性 对 O
7、A 诱 导 的 胰 岛 细 胞 凋 亡 能 够 起 到 一 定 保 护 作 用 。 本 研究 为 2 型 糖 尿 病 的 治 疗 提 供 新 的 理 论 基 础 ， 并 为 其 药 物 开 发 提 供 一 个 可 能 的 靶 点 。【 关 键 词 】 糖 原 合 成 酶 激 酶 3； 细 胞 凋 亡 ； 油 酸 ； 氯 化 锂2华中科技大学博士学位论文第 二 部 分PERK 激 活 在 油 酸 引 起 的 糖 原 合 成 酶 激 酶 3 活 化 中 的 作 用【 目 的 】 内 质 网 应 激 是 2 型 糖 尿 病 胰 岛 细 胞 发 生 凋 亡 的 重 要 机 制 ， PERK 是 一种
8、重 要 的 内 质 网 跨 膜 蛋 白 ， 内 质 网 过 度 活 化 可 以 持 久 的 激 活 PERK 从 而 引 起 细 胞 凋 亡 。我 们 在 前 期 的 工 作 中 已 发 现 FFAs 通 过 活 化 GSK-3 导 致 胰 岛 细 胞 凋 亡 ， 而 长 时 间 暴露 于 FFAs 可 引 起 胰 岛 细 胞 发 生 内 质 网 应 激 。 本 研 究 旨 在 探 讨 内 质 网 应 激 和 GSK-3在 胰 岛 细 胞 凋 亡 中 的 作 用 并 探 讨 其 可 能 的 信 号 通 路 。【 方 法 】 采 用 Western Blot 法 分 别 检 测 内 质 网 应
9、激 相 关 信 号 因 子 和 激 酶 在 OA 处理 前 后 的 变 化 ， 明 确 内 质 网 应 激 是 否 参 与 OA 诱 导 的 胰 岛 细 胞 凋 亡 。 同 时 用 ELISA法 检 测 PERK 和 AMPK 两 种 激 酶 在 OA 处 理 后 活 性 的 改 变 。 然 后 分 别 抑 制 PERK 和AMPK 的 活 性 ， 再 用 Western Blot 法 检 测 GSK-3 活 性 的 变 化 ， 此 时 用 Compound C 来抑 制 AMPK 的 活 性 ， 而 PERK 活 性 的 抑 制 是 通 过 过 表 达 P58IPK 质 粒 来 完 成 。
10、最 后 采用 免 疫 共 沉 淀 和 直 接 细 胞 荧 光 免 疫 法 确 定 PERK 和 GSK-3 是 否 存 在 共 同 作 用 。【 结 果 】 1. OA 诱 导 胰 岛 INS-1 细 胞 凋 亡 对内质网应激相关信号因子和激酶的影响加 入 0.4mM OA 后 ， GRP78、 ATF6、 XBP1、 PERK 和 AMPK 的 表 达 水 平 均 增 加 ， 在 统计 学 上 均 具 有 显 著 性 差 异 （ P0.05). 4. Identification of interactionbetween PERK and GSK-3 by co-immunoprecipi
11、tation. Co-immunoprecipitation ofPERK and GSK-3 verified the association of PERK and GSK-3. 5. Co-localization of7华中科技大学博士学位论文PERK and GSK-3 in INS-1 cells. Obvious co- localization was observed after mergingFITC-conjugated PERK (green) and Rhodamine-conjugated GSK-3(red).Conclusion: Activation of G
12、SK-3 can induce beta cells apoptosis by ER-stress whichis caused after long-time exposure to FFAs. PERK, a biomarker of ER-stress will activateGSK-3 directly. Collectively, PERK-GSK-3 signal pathway will play an important roleduring beta cell apoptosis in type 2 DM.Key Word: ER-stress; glycogen synt
13、hase kinase 3； PERK; oleic acid; beta cells8华中科技大学博士学位论文英 文 缩 写 词 及 中 文 对 照 缩 写 全 称 中 文AP ammonium persulfate 过 硫 酸 胺AMPK AMP-activated protein kinase 腺 苷 酸 活 化 蛋 白 激 酶ATF6 activating transcription factor 6 激 活 转 录 因 子 6BSA bovine serum albumin 牛 血 清 白 蛋 白ER endoplasmic reticulum 内 质 网EDTA ethylened
14、iamine tetra-acetate 乙 二 胺 四 乙 酸 盐FFAs free fatty acids 游 离 脂 肪 酸PERK PRKR-like endoplasmic reticulumkinase蛋 白 激 酶 样 内 质 网 激 酶GSK-3 glycogen synthase kinase 3 糖 原 合 成 酶 激 酶 3GRP78 Glucose regulation protein 78 葡 萄 糖 调 节 蛋 白 78IFG Impaired fasting glucose 空 腹 血 糖 受 损LiCl lithium chloride 氯 化 锂OA Olei
15、c acid 油 酸PI propidium Iodide 碘 化 丙 啶SDS Sodium dodecyl sulfate 十 二 烷 基 磺 酸 钠SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis十 二 烷 基 硫 酸 钠 -聚 丙 烯酰 胺 凝 胶 电 泳UPR unfolded protein response 未 折 叠 蛋 白 反 应XBP1 X-box binding protein1 X 盒 结 合 蛋 白 1独 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 ， 本 学 位 论 文 是 本 人 在 导 师 指 导 下 进 行 的 研 究 工 作 及 取 得 的 研究 成 果 的 总 结 。 尽 我 所 知 ， 除 文 中 已 经 标 明 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 包 含 任 何 其他 个 人 或 集 体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 研 究 成 果 。 对 本 文 的 研 究 做 出 贡 献 的 个 人 和 集体 ， 均 已 在 文 中 以 明 确 方 式 标 明 。 本 人 完 全 意 识 到 本 人 将 承 担 本 声 明 引 起 的 一 切法 律 后 果 。 学 位 论 文 作 者 签 名 ： 日期： 年
