原位杂交组织化学实验技术第一节原位杂交组织化学概述

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1、中国试剂网 3.18.3 原位杂交组织化学实验技术 第一节 原位杂交组织化学概述 一、核酸分子杂交技术 1961 年 Hall 开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子 单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链 区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是 70 年代末到 80 年代初，分子克隆、质粒和噬菌体 DNA 的构建成功，核酸自动合 成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌 现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应 的两条核酸链都游离在溶液中， 而固相杂交是将参

2、加反应的一条核酸链固定在固 体的支持物上 （常用的有硝酸纤维素滤膜， 其它如尼龙膜、 乳胶颗粒和微孔板等） ， 另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。 固相杂交有菌落原位杂交 （colony in situ hybridization） 、 斑点杂交法 （Dot blot） 、 Southern 印迹杂交 （Southern blot） 、 Northern 印迹杂交（Northern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization） ，即原位 杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。 液相分子杂交技术包括吸附杂 交、 发光液相杂交、 液相夹心杂交和复性速

3、率液相分子杂交等 （详见第十八章 ） 。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization） ，如 上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何 一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出 DNA，然后进行杂交。 Southern印迹杂交法是以鉴定 DNA中某一特定的基因片段，而 Norhtern印迹杂 交法是用以检测某一特定的 RNA 片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组 织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。 1969年美国耶鲁大学 Gall 和 Pa

4、rdue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂 交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno Nardelli 和 Amaldi,John 及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因 定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用 3H 标记的 兔乳头状瘤病毒 cRNA 探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交， 首次用原位 杂交检测了病毒 DNA 在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培中国试剂网 3.18.3 养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限 制等缺点，

5、科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂 交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记 cRNA 探针做原位杂交，然后用荧 光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用 2，4二硝基苯甲醛（DNP）标 记 DNA探针，使该 DNA探针具有抗原性，然后用兔抗 DNP 的抗体来识别杂交 后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有 采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella （1987） 创建了用磺基化 DNA 探针来做细胞或组织原位杂交的方法， 其基本原理是使 DNA 探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺基化探 针

6、，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定 位。本法的优点是磺基化 DAN 探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也 较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标 记探针技术是 Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片 上检测了病毒 DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显 示系统显示病毒 DNA在细胞中的定位。 生物素标记探针技术目前已被广泛应用， 特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。 这种生物素标记技术又叫酶促生物素标 记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素 （Pho

7、tobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素， 它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图 20-1） 。在强光下， 不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标 记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每 100150 个碱基才能 标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记 数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985） 。 图 20-1 光敏生物素结构图 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。 Boeringer Mannhem Biochem

8、isca于 1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投 放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省中国试剂网 3.18.3 时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基 因组 DNA 中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸 酶-抗碱性磷酸酶显色系统） ，有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。 根据探针的核酸性质不同可分为 DNA 探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA 探 针和寡核苷酸探针等。DNA 探针还有单链 DNA（Single stranded, ssDNA）和双

9、 链 DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章 ） 。早期应用的主要是 DNA 探针，继之 Temin 在 70 年代研究致癌 RNA 病毒时制备了 cDNA 探针 （complementary DNA） ，其基本原理是以 RNA 为模板，经逆转录酶（reverse transcriptase） 又称为 RNA 指导的 DNA 聚合酶催化产生的。 该酶以 RNA为模板， 按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA，这一途径与一般遗传信息流的方向相反，故 称逆转录。 CDNA是指互补于 mRNA的 DNA分子。 RNA探针是将特异性的 cDNA 片段插入含有相当的 RN

10、A 聚合酶启动子的转录性载体。这类载体包括 pSP64 和 pSP65，它们具有不同的启动子在多克隆位点的各侧。Psp64 和 pSP65 在 sP6 启 动子的多克隆位点的方向是不同的。 通过改变外源基因的插入方向或选用不同的 RNA聚合酶，可以控制 RNA 的转录方向，即以哪条 DNA 链为模反转录 RNA。 从而可以得到与 mRNA 同序列的同义 RNA 探针（Sense probe）和与 mRNA 互 补的反义 RNA 探针 （antisense probe） ， 又称互补 RNA 探针 （complementary RNA probe , cRNA） 。 通常用同义 RNA探针做为反

11、义 RNA探针的阴性对照。 由于 RNA 探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。有报告认为其杂交率高于 DNA探针的 8倍。 DNA 合成仪的诞生使制造寡核苷酸探针成为可能，与上述探针不同的是寡 核苷酸探针不是克隆性 DNA 探针，它是由 DNA 合成仪依照所需杂交的靶核苷 酸序列合成的。具有制造方便，价格低廉的优点，也可进行放射性与非放射性标 记，但其特异性不如克隆性探针强，亦不如其杂交信号高。 原位杂交组织化学技术在近 20 年的发展可以说是飞跃的，其突出的特点是 由分子遗传学研究提供的探针大量增加，探针生产的可靠性和速率大大发展了， 更重要的是非放射性标记物的发展使原位杂交组织化

12、学技术在不久的将来将和 现今的免疫细胞化学技术一样成为实验室的常规技术和临床日常应用的诊断技中国试剂网 3.18.3 术。新的非放射性标记技术正在继续不断涌现。Coulton（1991）建议将非放射 性标记技术更名为亲合复合物标记技术（Affinity Complex Labelled Probes, ACLP ） 。因为“非（non）“在英文里是一个否定的名词，而且根据非放射性标记 技术的原理是将一个标记物利用其亲合性， 应用直接或间接的方法结合在核苷酸 分子上。 原位杂交组织化学技术在生命科学的研究中可视为一项革命性的技术。 它使 它们的研究从器官、组织和细胞水平走向分子水平。为各个学科的

13、研究带来突破 性的进展。其中特别突出的是细胞或组织的基因表达、染色体分析、病毒诊断和 发育生物学。我们在下节 将详加叙述。 三、原位杂交组织化学技术的基本方法 如前所述，由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上 也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：杂交前准备， 包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染 色等；杂交；杂交后处理；显示（visualization） ：包括放射性自显影和 非放射性标记的显色。 （一）固定 原位杂交组织化学技术（In Situ Hybridization Histochemistry, ISHH）在固定

14、 剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内 DNA 或 RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。 DNA 是比较稳定的， mRNA 是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA 却绝然不同，非常容易被降解。因此， 对于 DNA 的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。相反，在 RNA 的 定位上，如果要使 RNA的降解减少到最低限度，那么，不仅固定剂的种类浓度 和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释 ISHH的结 果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对 RNA 保存所带来的影响，因 组织中 mRNA 的降解是很快的。在固定剂中，最常用的是多

15、聚甲醛。和其它的 固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不 会影响探针穿透入细胞或组织。 其它如醋酸-酒精的混合液和 Bouins 固定剂也能 获得较满意的效果。对于 mRNA 的定位，我们常采用的方法是将组织固定于 4% 多聚甲醛磷酸缓冲液中 12h，在冷冻前浸入 15%蔗糖溶液中，置 4冰箱过夜，中国试剂网 3.18.3 次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。 组织也可在取材后 直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入 4%多聚甲醛约 10min，空气干燥后保存 在-70。如冰箱温度恒定，在-70可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理 学活检取材多用福尔马林固定和石蜡包埋， 这种标本对检测 DNA 和 mRNA有时 也可获得杂交信号，但石蜡包埋切片由于与蛋白质交叉连接的增加，影响核酸探 针的穿透，因而杂交信号常低于冰冻切片。同时，在包埋的过程中可减低 mRNA 的