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1、1 RNA 干扰研究前沿和应用领域 小 RNA(MicroRNA,miRNA)的作用与应用研究继 2001,2002 连续两年被美国Science 杂志评选 为年度 10 大突破技术以来,2003 年继续热度高涨,名列前矛。其核心技术 RNA 干扰(RNAi),即用 20 多个核苷酸组成的短的双链(siRNA )代替传统反义核酸进行转录后基因沉默,已经迅速而广 泛地应用到基因功能,基因表达调控机制研究等热门领域,并为基因治疗开辟了新的途径。近两年来, 这方面的科学论文及报道爆炸性增长,几乎每天都有新的结果涌现。此外,RNAi 沉默机制的探索方面也 取得了相当的进展。在大致勾画出生物体内源性小
2、RNA 的重要作用框架后,2003 年生物学家致力于阐 述更进一步的细节,探索小 RNA 如何调控细胞的行为,如何利用 RNAi 机制进行疾病防治等等。以下就 分几个方面为大家介绍一些近几年 RNA 干扰的主要研究领域及前沿进展。 一 外源 RNA 诱导 RNAi 的应用 1. 基因功能研究从 2001 年Nature杂志上首家报道在哺乳动物培养细胞中通过 siRNA 成功诱导了特异性靶基因 表达沉默后,RNA 干扰技术就作为一项特异性基因沉默的有效工具从低等生物成功进军哺乳动物领域。 2003 年 Rubinson DA 等又在 Nature Genetics 上报道用病毒系统在原代哺乳动物
3、细胞,干细胞和转基因 小鼠上都取得了 RNA 干扰成功,更大大扩展了这项技术的应用范围。研究者们可以利用这项技术对目标 基因进行特异性地表达沉默,通过观察其表达被抑制后细胞以至生物体从形态到各项生理生化的变化, 对该基因的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多,因此短短 几年,就有了很多突破性的成果。其中研究得最多的是跟疾病相关的一些基因,不仅对疾病机制及相关 代谢网络有了进一步认识,也为基因治疗及药物筛选提供了一些借鉴。 在具体诱导方式方面,目前报道的成功的 siRNA 形式多样,其中短发夹结构 RNA (shRNA,short hairpin RNA )表达
4、载体的应用大大加快了研究者从最初的培养细胞水平扩展到成体水平的步伐。例如, 在神经生物学研究中,美国 NIH 的 Backman C 等通过 siRNA 表达质粒对中脑腹侧神经细胞中的多巴胺 能相关基因进行了有效抑制, Hommel JD 等还通过病毒介导的 RNAi 建立了此类成年小鼠模型,不仅为 建立神经系统的功能缺失模型找到了一些有价值的表型标记,对神经系统的基因治疗也有一定借鉴意义; 在癌症研究中,Zhang Y 等也通过 shRNA 表达载体成功抑制成年大鼠脑癌基因,并对 RNAi 的远程(穿 过血脑屏障)基因沉默方法进行了非常有益的探索;利用细胞凋亡途径,Zender L 等通过
5、RNAi 抑制凋 亡基因 Caspase8 能提高患急性肝功能衰竭小鼠的成活率,并发现 Caspase 8 siRNA 处理对特异性 Fas 激活剂(Jo2 和 AdFasL )和野生型腺病毒介导的急性肝功能衰竭都有效,表明这个动物模型能反应 人类急性病毒肝炎多分子参与的机制,增强了 siRNA 用于急性肝炎病人治疗的希望 除了对某些关键基因的 RNAi 研究外,Zheng L 等还在哺乳动物细胞中探索了 siRNA 在基因组水平上的2 筛选方法。他们建立了一个包含 8000 多个基因的 siRNA 表达框文库阵列,通过它来高通量筛选 NF-kB 信号途径中已知的及 Unique 基因。由此可
6、见,RNA 干扰也正作为筛选成百甚至上千基因的工具,发挥 着越来越大的作用。总的来说,RNA 干扰为系统地抑制 RNA 分子合成蛋白提供了快速而相对简便的途径。通过在一段 时间内对一个基因 RNA 信号的抑制,研究者可以深入研究基因功能,进而开始描绘支配从细胞形态到信 号系统的遗传网络。 2. 基因治疗及药物筛选探索由于 RNA 干扰是针对转录后阶段的基因沉默,相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程 设计更简便,且作用迅速,效果明显,为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的 RNAi 机制,控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。尤其针对引起一些对人
7、 类健康严重危害的核酸病毒,如去年在全球多个国家和地区流行的 SARS 这种主体是单链核酸的新型冠 状病毒,寻找药物靶点,设计核酸药物就更加方便。目前已经有很多公司在积极开发这方面的药物,如 在去年 SARS 药物研究中一鸣惊人的美国俄勒冈州的 AVI BioPharma 生物制药公司等。国内也有很多研 究机构及生物技术公司投入了这方面的工作。如上海生科院成立了 SARS 防治科研攻关领导小组,其中 生化细胞所和药物所的一些课题组在从 RNA 干扰的角度努力。此外,北大,中南大学,北京动物所等大 专院校研究机构以及北京金赛狮反义核酸技术开发有限公司等也开展了 RNA 干扰药物的研究与开发。基因
8、治疗方面去年最引人注目的进展之一是对肝炎的 RNA 干扰研究。McCaffrey AP 等通过表达 shRNA 的载体在培养细胞水平和转染 HBV 质粒后免疫活性缺失的小鼠肝脏中成功抑制了 HBV 复制。与 对照相比,小鼠血清中测得的 HBsAg 下降 84.5 ,免疫组化对 HBcAg 的分析结果下降率更超过 99% 。 另,哈佛大学 Lieberman 的研究小组通过注射针对 Fas 的 siRNA ,过度激活炎症反应,诱导小鼠肝细胞 自身混乱。然后给测试小鼠注入使 Fas hyperdrive 的抗体,发现未进行 siRNA 处理的对照组小鼠在几天 中死于急性肝功能衰竭,而 82%的 s
9、iRNA 处理小鼠都存活下来,没有患病,它们当中 80-90的肝细胞 经证实结合了 siRNA。并且,RNAi 发挥功能达 10 天,三周后才完全衰退。由于 Fas 很少在肝细胞外的 其它细胞高表达水平,对它的抑制对其它器官几乎没有副作用。 此外,这个小组还和其它研究者积极开 展针对 HIV 的 RNAi 测试,目前报道他们使用的针对 CCR5 蛋白的 siRNA 能阻止 HIV 进入免疫细胞约三 周,在已经感染的细胞中也能阻止感染病毒的复制。 然而,尽管取得了不少成果,要真正用于医疗还需时日。目前大多数还停留在小鼠测试阶段,siRNA 的导入多采用静脉或腹腔注射,尾部注射,细胞移植等,如何对
10、人进行有效的给药,既能确保药效在靶3 器官靶组织有效释放,还要具有高度安全性等等问题都尚需进一步研究。我们期待着 RNAi 引领的新医学 革命的到来。 在药物筛选领域,除了线虫这种低等动物的 RNAi 高通量药筛模式外,2003 年 Lavery KS 等的综述中也 对 RNAi 在药筛领域的应用前景进行了高度评价:RNAi 技术将逐渐成为药物靶点筛选和鉴定的强大工具。 他对如何在药筛的各个阶段应用 RNAi 做了具体描述及展望,并指出将这项技术与高通量筛选,体外生物 检测和体内疾病模式相结合,将提供大量基因功能方面的有用信息,在药物开发过程的多个阶段促进靶 点的筛选。 二 内源 RNAi 机
11、制及功能研究是什么原因使我们有可能通过外源 siRNA 诱导内源性的靶 基因转录后沉默?为解开这个迷题,更有效地进行 RNAi 应用, 随着 RNAi 应用研究的广泛开展,生物体内部 RNAi 机制研究也 愈加深入,并迅速成为 RNAi 研究中的重要领域,吸引着越来越 多的研究者投身其中,涌现出一系列令人耳目一新的成果。多年来,生物学家认为 RNA 在生命过程中的作用仅仅是将 遗传信息从 DNA 传递到蛋白,就象蜂群中的雄蜂般没有创意。但近几年的一系列发现使研究者对 RNA,尤其是 mRNA 以外的哪些小 RNA 的功能有了全新的认识。生物体中有一群小 RNA (目前看来人 体中编码约 255
12、 种小 RNA ,竟占整个基因组近 1% ,很多可能编码自以前被认为“ 垃圾 DNA” 的区域), 它们也可通过自身的 RNAi 机制,在生命过程的各个阶段关闭或调控基因表达水平,从而控制细胞的多种 生命活动。尤其在发育过程中 2003 年有一些激动人心的最新发现:仅约 22 个核苷酸长度的小 RNA ,发 现竟能引导早期发育从使植物叶片成形到介导果蝇胚胎在植物组织中的细胞增殖;缺少 RNAi 蛋白 Dicer (一种 RNA 酶 III 家族的酶,参与 RNAi 过程中对 RNA 的剪切)的小鼠会缺少干细胞的某些分化系 (swaths of stem cells),在出生前就夭折;小鼠中特定
13、的小 RNA 能帮助引导干细胞生成胚胎的血细胞 系统。此外,有些 RNAi 现象能在 DNA 编码不变的情况下传代,甚至在一些物种中对基因组进行调整,有 人形象地比喻它为“引导基因组的手” ,生动体现了小 RNA 源于基因组但对基因组所具有的强大反馈作用。 Science 上一篇题为“RNAi Extends Its Reach” 的综述详细阐述了 RNAi 途径已经不仅仅限于沉默 mRNA,还作用于基因组。这方面的具体机制还不是非常明确,但在植物中发现伴随有 DNA 甲基化现象,4 科学家们预测要描绘一张完整的 RNA 引导基因组改变的图谱可能需要对 RNA 信号,DNA 甲基化和组蛋 白修
14、饰之间的相互作用进行更进一步的研究。 综合来看,我们可将目前报道的内部 RNAi 机制可能的功能,大致分为以下几类: 1. 抗病毒功能Voinnet 和 Li 等分别在植物和果蝇中发现了通过 RNAi 实现的抗外源核酸机制:被大多数 RNA 病毒 启动的 RNAi 可导致病毒基因组降解。例如在果蝇细胞中, Flock house virus (FHV)就能引发果蝇内部 的 RNAi 反应,产生 FHV 特异性的 siRNA 来降解感染的 FHV。 2. 基因调控目前在人、蠕虫,果蝇和植物等生物体中都发现了小 RNA,有的通过结合 3非翻译区(UTR )和 靶 mRNA 抑制 mRNA 翻译,有
15、的作为 siRNA 通过 RNAi 机制破坏靶基因转录本,对基因表达水平进行 调控。 3. 染色质浓缩内源的 siRNA,一些小 RNA 可能通过使染色质浓缩调节基因表达。一些研究小组发现 dsRNA 结合 到植物启动子区域能通过一种使 DNA 甲基化的作用导致基因沉默;在蠕虫体内检测到许多 Polycomb 蛋 白(能结合染色质)是 RNAi 过程所必须的;裂殖酵母中内源 siRNA 可介导中心粒区染色质浓缩,导致 这个位点的基因转录沉默。如 Vera Schramke 等在裂殖酵母中通过合成 shRNA 反式抑制同源位点,导 致在 mate 区沉默的 Swi6 染色质浓缩。这些结果都提示一
16、些内源性的 siRNA 通过导致染色质浓缩来调节 基因水平。 4. 转座子沉默目前,两方面的证据提示转座子沉默涉及 siRNA。其一,发现蠕虫 mut-7 基因参与 RNAi 和转位抑 制。其二,从裂殖酵母的中心粒区也分离出 siRNA,并检测到这些 siRNA 介导此区内组蛋白甲基化。由 于中心粒区包含重复序列含转座子片段,在一些减数分裂基因中也发现了通过其附近的逆转录转座 子 LTR (长末端重复序列)介导的 RNAi ,推测在 siRNA 介导的中心粒区域的组蛋白甲基化可能源于古 老的转座子沉默作用。 5. 基因组重组siRNA 可能参与纤毛虫,四膜虫虫体间结合时的基因重组。结合到重组序列的 siRNA ,在虫体之间 的结合过程中介导 DNA 缺失和染色体断裂。有趣的是,在这些 siRNA 介导的程序性 DNA 删除事件中, 也发现需要重组区域组蛋白的甲基化。结语:RNAi 的确有太多的值得研究的领域和值得期待的发现,我们真诚地希望中国科学界能在探索 小 RNA 世界的潮流中占据令人瞩目的一席。