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1、抗生素微生物检定法的增修订内容及操作要点北京市药品检验所王国兰抗生素微生物检定法l 1抗生素微生物检定法的概况l 2微生物效价测定法国内外药典的比较l 3微生物效价测定法的操作要点l 4微生物效价检定法的建立和方法学验 l 证1抗生素微生物检定法的概况 l 1 1定义 l 抗生素微生物检定法是利用抗生素在低微浓度下有选择地抑制或杀死微生物的特点，以抗生素的抗菌活性为指标，来衡量抗生素中的有效成分效力的方法 。l l 1 2微生物检定方法l 1 2 1. 概述l 抗生素微生物检定法是国际上通用的、经典的抗生素效价测定方法。自 20世纪 40年代建立至今，在各国药典中被普遍采用。虽然伴随着HPLC
2、等化学分析技术的发展，一些抗生素品种的效价测定已被化学方法所取代，但由于以下的原因，抗生素微生物检定法目前在各国药典中仍占有重要地位，且短期内化学分析法不可能取代微生物检定法： l （ 1）微生物检定法可直观、特异地反应出抗生素药品的抗菌活性，显示临床的特点；l （ 2）多组分抗生素由于不同活性组分生物活性的差异，化学测定结果难以准确表征组分组成、含量和活性的关系；l （ 3）许多抗生素品种由于各种原因目前没有适当的化学分析方法表征其活性；l （ 4）同时微生物法所需仪器设备简单，成本低。l 1 2 2抗生素微生物检定法分类l 抗生素微生物检定法可分为：l （ 1）稀释法l （ 2）比浊法l
3、（ 3）琼脂扩散法（管碟法和打孔法）。l 目前各国药典通常采用后两种方法测定抗生素的效价。 1 2 3. 抗生素微生物检定方法比较：抗生素微生物检定方法比较：2微生物效价测定法国内外药典的比较 美国药典 28版英国药典 2002版欧洲药典 2002版日本药局方 XIV版 中国药典 2005版3微生物效价测定法的操作要点 l 3.1管碟法 基本原理检定的影响因素 效价测定基本操作及注意事项 操作要点方法的特点菌种的传代l 3.1.1原理：l 利用抗生素在摊布待定试验菌的琼脂培养基中扩散，形成一定浓度的含抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的抑菌圈；并且在一定的抗生
4、素浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈的面积或直径成正比。管碟法的基本公式l 根据两位微生物学者 Hamphrey Light和Brown推导出的琼脂球面扩散动力学公式：l 该方程奠定了管碟法量反应直线公式的基础。l 将上述公式简化、移行，并将自然对数转换为常用对数得：l 上述公式表明，抗生素总量的对数 (lgM)与所形成的抑菌圈半径的平方 (r2)呈直线关系，即通过抑菌圈的大小来测定抗生素抗菌活性物质的量。 量反应平行线原理： l定义 ：当抗生素浓度的对数剂量和反应呈直线关系，且供试品和标准品的作用性质相同时，供试品和标准品的两条量反应关系曲线相互平行。3.1.2检定的影响因素： l 3.1
5、.2.1. 标准品与供试品的同质性l 抗生素效价测定依据的原理是量反应平行线原理，即标准品与供试品的剂量反应直线是相互平行的，若不平行，则斜率不等，计算结果将产生较大的误差。造成二者不平行的原因： l （ 1）标准品和供试品内在质量的不同所致。如多组分抗生素标准品所含的抗菌活性物质或影响抗菌活性物质的量与供试品有所不同，可使量反应平行线不平行。l （ 2）用于制备标准品溶液和供试品溶液的缓冲液pH、 盐浓度的差异。l （ 3）供试品制剂中含有维生素、氨基酸、无机盐及糖类等生长物质，导致在低营养条件的培养基上影响细菌的生长速率。l （ 4）化学稳定性较差的抗生素，由于降解导致供试品与标准品不同质
6、。l （ 5）操作上可能引入的误差。l 3.1.2.2抑菌圈质量的控制l （ 1） 抑菌圈的形状：l 实验中抑菌圈常有圈破裂、不圆、甚至无圈的现象，其原因是多方面的 : 在滴加抗生素溶液时药液溅出、毛细滴管碰到钢管壁使抗生素溶液漏出，出现不圆等； 双碟、钢管、钢管放置器内有残留抗生素污染； 试验菌菌龄过老、菌层培养基加菌液时培养基温度过高，将检定菌烫死等； 稀释抗生素溶液所用缓冲液的 pH值和盐浓度也可影响抑菌圈的圆整，如氨基糖苷类抗生素，当缓冲液的 pH值偏低、盐浓度偏高时，会出现无抑菌圈或呈向心形、椭圆形抑菌圈。 （ 2） 抑菌圈大小的控制 抗生素抑菌圈大小受浓度、加样量、最低抑菌浓度、扩
7、散系数、扩散时间、培养基的厚度的影响 当抗生素浓度不变时，加样量的对数与抑菌圈直径或面积呈直线关系，故钢管中滴加抗生素的体积应一致。钢管（截面积，高度）的大小（重量、直径、高度）应严格控制。 抑菌圈大小受抗生素扩散时间的影响，故预先延长抗生素的扩散时间可使抑菌圈变大。 操作中若各钢管中加液时间不同，可影响抑菌圈的大小，所以一组双碟加样时，应尽量缩短加样间隔时间，并保持加样速度的均匀性，以减少误差。 抑菌圈的大小还受抗生素扩散系数的影响，若在缓冲液中加入 0.3%的氯化钠或在培养基中加一定量的盐或吐温，可增加抗生素的扩散能力，使抑菌圈增大。 l （ 3） 抑菌圈边缘清晰度的控制 l 抑菌圈边缘清
8、晰度是影响测定结果的重要因素之一，导致抑菌圈边缘不清晰的原因如下： 在抑菌圈形成过程中抗生素的扩散系数紊乱、不均一，不符合动力学公式中各项之间的关系或各扩散系统交叉所致。 如试验菌种放置时间过长，菌群中个体的生长周期不同，对抗生素的敏感度不同，往往使抑菌圈形成双圈或多圈，使边缘模糊不清。 培养基原材料的成分及质量、 pH值、盐浓度及培养时间均可影响抑菌圈边缘的清晰度。 l 3.1.2.3 斜率的控制由公式中斜率（ 1/9.21DT） 来推算： 如扩散快，即扩散系数 D值大，则斜率小；如细菌生长慢，时间长， T值大，则斜率小。反应直线的斜率愈小愈好，因为斜率越小，直线越平稳，抗生素效价的微弱差别
9、，可导致抑菌圈大小的差别较大，使测定结果更精确。 如扩散系数 D值不变， T值变小，则试验菌生长快，时间短，斜率就大，这样生物反应的灵敏度低，重现性差。为使 T值增大，可在滴加药液后，在室温放置约 1小时，再置孵箱培养 。 l 3.1.2.4直线截距的影响l 相同浓度的抗生素，截距小的抑菌圈大，效价测定的灵敏度高。截距的大小取决于l lgC4DTH的数值，除温度、扩散系数和抗生素最低抑菌浓度对截距有影响外，培养基厚度 H也是影响因素之一，培养基厚度越薄，截距减小，抑菌圈增大，所以在制备双碟时，应保持在相同的试验组内，每只双碟中底层和菌层培养基的厚度应保持一致性和均匀性。 l3.1.3管碟法的基
10、本操作及注意事项：管碟法的操作步骤：预 试验 试验准备 双碟的制备供试品、标准品溶液的制备 菌层的制备 滴加抗生素溶液双碟的培养 抑菌圈的测量结果的可靠性检验及效价测定l 3.1.3.1 预试验：l 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素终浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 18 22mm， 三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在 1518mml 3.1.3.2试验准备 ：l 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等。l 3.1.3.3 双碟的制备：l
11、 每只双碟加底层培养基约 20ml， 待培养基凝固后，将双碟放入 35 37 培养箱中，待用。l 3.1.3.4 供试品、标准品溶液的制备：l 估计供试品的效价，根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤，平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液。l 3.1.3.5 菌层的制备：l 注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量，注意制备菌层的速度和平整度。l 3.1.3.6滴加抗生素溶液：l 注意标准品、供试品高、低剂量溶液滴加顺序，保证滴加速度和加量的均匀一致。l 3.1.3.7 双碟的培养：l 根据培养温度的要求在培养箱中进行培养，培养箱中水平碟放的双碟数以不超过三层为宜。l 3.
12、1.3.7 抑菌圈的测量：l 抑菌圈测量仪的使用，每组试验双碟应在相同的测量参数下进行测量。l 3.1.3.8 结果的可靠性检验及效价的计算3.1.4重试判定 l （ 1） 抑菌圈大小不符合规定：l 二剂量法：高浓度抑菌圈直径 18 22mml 三剂量法：中浓度抑菌圈直径 15 18mm(2)实验未通过可靠性检验。l F(偏离平行 )应不显著（ P 0.05）。l 偏离平行：表示标准品（回归系数）与供试品反应直线斜率是否有显著性差异。若 F(偏离平行 )不显著（ P 0.05）。 此时平行关系是可靠的。l (3) 供试品效价测定结果（ PT） 的可信限率除特殊规定外，不得大于 5。l 可信限率
13、是反应检定结果精密度的统计量。l （ 4）如果所测得的效价结果低于估计效价的 90%或高于 110%时，则检验结果只作为初试，应调整供试品估计效价，重新试验。l （ 5）效价测定结果不符合规定时，需换人加倍复试。3.1.6操作要点 l (1)试验菌需新鲜培养，传代不超过 5次，以防止菌种老化变异。芽孢杆菌培养物用灭菌水洗下后，应在 65 加热 30分钟，使菌体的菌龄一致，用革兰氏染色，应有芽孢 85以上。l (2)加入菌悬液的体积，一般不大于上层培养基体积的 3。如果加入菌悬液的体积过大，则会使上层培养基变稀，并且因菌悬液的温度较低，加至培养基中可能造成培养基结块，影响测定结果。对于加入菌悬液
14、体积的控制，可通过调节菌悬液的浓度来实现。l l l (3) 放置孵箱培养时排放应不得超过三层，避免因培养温度不均匀而导致各双碟中抑菌圈大小不一。l (4) 溶解：对于需用乙醇溶解的样品，由于溶解样品时所用乙醇量较大，加灭菌水后溶液放热，因此需充分摇匀后加灭菌水至接近容量瓶刻度，待冷至室温后再稀释至刻度。l (5)标准品溶液与供试品溶液浓度的比值应控制在 2以内，以保证两者浓度的偏差在一定范围内。 3.1.8 菌种的传代菌种的复苏菌种的验证菌种的选择菌种的保存菌种的复壮 l 3.1.7管碟法特点 l 优点：l 基本操作和设计适用于各种抗生素，试验结果较稳定；l 样品用量少，灵敏度高 ;l 适合于大批样品的测定。l 缺点 :l 凡具有抗菌活性的物质都会干扰测定结果；l 试验过程长，需第二天才有结果；l 操作手工化，需熟练人员才能得到较正确的结果；l 受扩散因素的影响，如培养基原材料的质量，一般琼脂中的杂质可能影响扩散速度及效价强度。3.2比浊法 l 1基本原理： 细菌接种于澄清的营养丰富的液体培养基中，在一定的温度下培养一段时间，变浑浊，其浑浊程度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌群体细胞容积的增大之间存
