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1、1,北华大学医学检验学院赵云冬,实验 9 分光光度计的性能检查和日常监测,2,实验目的,掌握：分光光度计的性能检查方法。熟悉：分光光度计的日常监测。了解：分光光度计的波长调整方法。,3,试剂与器材,1伊文斯蓝溶液 2重铬酸钾溶液3硫酸镍溶液 4白纸条、黑纸片、镨钕滤光片5分光光度计、比色杯,4,操作步骤,1波长检查 可见光区域的黄色光波段较窄，适用于光度计波长的目测初步检查；镨钕滤光片在529nm(12)nm处有较好的吸收峰，适用于光度计波长的精细检测。 （1）目测检查 调节波长至580nm处，打开样品室盖板，在比色槽中光路经过处放一白纸条，观察黄色光斑是否光强均匀、边缘无光晕及杂光。 （2）
2、镨钕滤光片检查 调节波长至529nm处，打开样品室盖板，调节透光度为0%，盖上样品室盖板以空气调节透光度为100%，将镨钕滤光片插入光路，测出吸光度值。再在529nm附近每隔1nm2nm，分别测其吸光度值。,5,2杂光检查 通过吸收池的透过光与杂光成正比，因此可用其透光度表示杂光的大小。（1）调整仪器波长至585nm处，盖上样品室盖板，用黑纸挡住比色杯光路，调透光度为0%。（2）盖上样品室盖板，用空气作空白调透光度为100%。 （3）插入镨钕滤光片，盖上样品室盖板，测出585nm时的透光度。,操作步骤,6,3比色杯配套 一套比色杯之间的材质、厚薄、色泽、空白吸收等应该一致，误差小于0.5%才能
3、配套使用。（1）选取几只大小、材质、色泽相同的清洁比色杯，装入比色杯体积2/3的蒸馏水，擦干，放入比色槽。（2）在585nm处，调第1只比色杯透光度为100%，依次测出其他几只比色杯的透光度。,操作步骤,7,4线性检查 根据比耳定律，溶液吸光度与溶液的浓度成正比。用一种有色物质配成不同浓度，在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比耳定律，检查仪器本身是否能如实地反映有色物质的浓度变化。（1）调整仪器波长至610nm，用蒸馏水作空白调节透光度为100%，分别测定0.8mg/L、1.6mg/L、2.4mg/L、4.0mg/L伊文斯蓝溶液的吸光度。（2）用测得的吸光度对浓度作图。,操作步骤,8,5稳定
4、性检查 仪器的光源发光强度、检测器的稳定性受电源电压影响。调节电压，检查仪器稳定性。（1）将分光光度计接于0.5kVA以上的可调变压器，先调电压为220V，波长固定在650nm，在光路中的比色杯装空白液，调透光度为90%。（2）将电压升至230V及降至190V，观察透光度的变化值。（3）在电源电压不变的条件下，在3min内观察透光度的变化值。,操作步骤,9,6重复性检查 溶液浓度相同，透光度应相同，对同一浓度溶液分别多次测定透光度，观察透光度变化值。（1）配制含铬量为30mg/L、60mg/L、180mg/L的重铬酸钾溶液。（2）调整分光光度计波长至440nm，以蒸馏水调节透光度为100%，分
5、别将各浓度重铬酸钾溶液连续测3次5次透光度。,操作步骤,10,7灵敏度检查 吸光度应随溶液浓度变化而相应变化，测定不同浓度溶液吸光度，观察吸光度变化值。（1）将重铬酸钾溶液配制成含铬30mg/L和32.5mg/L及含铬120mg/L和122.5mg/L的4种浓度（两组溶液含铬浓度差均为2.5mg/L）。（2）调整波长至440nm，以蒸馏水调节透光度为100%，将上述4种浓度溶液连续测3次吸光度，记录吸光度值，计算每组含铬量浓度差为2.5mg/L的吸光度值差。,操作步骤,11,8日常监测 硫酸镍在400nm700nm之间有吸收峰，峰值在510nm。在400nm、460nm、510nm、550nm
6、及700nm处测定硫酸镍溶液的透光度，记录并保存。每个月用该溶液进行日常监测。比较前后两次的数据，即可知仪器的工作状态。,操作步骤,12,判定标准,1波长检查 在529nm1nm 处有最大吸收值为合格。2杂光检查 T%5%为合格。3比色杯配套 Tmax%-Tmin% 0.5%为合格。4线性检查 吸光度对浓度作图，成一条直线为合格。5稳定性检查 调节电压升至230V及降至190V，透光度介于88.5%91.5%之间为合格。在电源电压不变的条件下，3min内透光度的变化不应超过0.5%。6重复性检查 各组浓度中透光度最大误差应小于1%。7灵敏度检查 两组含铬量浓度差为2.5mg/L的吸光度差值都不
7、小于0.01为合格。,13,8日常监测 在400nm、700nm处透光度升高说明杂光增加。任一值增加3%就需要进行检修。在510nm处透光度升高说明带宽加大。如透光度升高2%，对于带宽为20nm的仪器就需要检修。在460nm与550nm处监测波长。这两处波长的读数，一个升高另一个就降低。如460nm的透光度升高，而550nm的透光度降低，说明透过比色杯样品的波长小于波长度盘指示的波长（图3-1甲）。反之，如460nm的透光度降低，而550nm的透光度升高，说明透过比色杯样品的波长大于波长度盘指示的波长（图3-1乙）。,判定标准,14,图3-1 硫酸镍溶液（吸收曲线）监测仪器工作状态,判定标准,
8、15,注意事项,1检查仪器性能时，要求电源电压稳定，应将仪器按要求预热。2波长检查时有些高档仪器编入扫描程序后，仪器即可自动地在一定波长范围内进行波长校正。3高档分光光度仪的光学系统密封在一个单元组件内，若发生故障，波长不准，需请制造商派专人修理。4比色杯配套检查时要求各比色杯内蒸馏水液面等高。,16,评价与分析,1波长检查 分光光度计在更换光源灯、重新安装、搬运或检修后，以及仪器工作不正常时，都要进行波长校正。2杂光检查 在吸光度检查中，凡检测器感受到的不需要辐射均称为杂光。杂光的来源有：仪器单色器的设计、光源的光谱分布、光学原件的老化程度、波带宽度以及仪器内部的反射及散射等；样品室盖板不严
9、，室内光线过强而漏入仪器；样品本身有无荧光、样品的散射能力强弱等。,17,3比色杯配套 比色杯的质量除其原料外，还要求玻璃的厚度均匀，上下一致，各杯彼此相配。4线性检查 线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。仪器偏离的因素很多，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。,评价与分析,18,5日常监测 分光光度计常用硫酸镍溶液检查仪器在可见光区范围内是否处于较好的工作状态（包括波长、杂光水平等）。,评价与分析,19,1. 比耳定律的具体内容是什么？说明其适用条件。 2. 分光光度计日常监测时460nm处的透光度升高，那么实际波长和波长度盘指示波长是什么关系？,思考题,20,返回总目录,谢谢！,
