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1、液態醱酵培養牛樟芝菌絲體 真菌液體醱酵培養又叫液體深層培養，就是將真菌菌種培植在液體培養基 中，保持適當的溫度，並給予充足的無菌空氣使之生長。在液體環境下，質量 與熱量傳送都非常有效率，菌絲的生長快速，完成一個生命週期只要七十天左 右。醱酵產物包括菌絲體和醱酵液。醱酵液中有大量的真菌菌絲代謝產物，通 常菌絲體和醱酵液二者都有藥用價值。液體深層醱酵培養的過程如下： 斜面試管接菌搖瓶通氣培養小型種子槽培養大型醱酵槽培養產物回收。 液體醱酵時，由於所用培養原料都是可快速吸收的養分，在不斷攪拌之下，微 生物很容易利用，因此一旦感染雜菌，就會馬上大量繁殖，從而造成醱酵失敗， 所以液體醱酵對無菌操作的要求
2、特別嚴格。 (1) 液體深層培養對培養基要求液體深層醱酵培養需要碳源養分、氮源養分和微量元素養分。牛樟芝深層 醱酵所需要的碳源養分有葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、澱粉等，其中最好利用的是 葡萄糖。葡萄糖、蔗糖、麥芽糖是小分子糖，培養基中用量過高時，會使培養 液的滲透壓提高，菌絲體為平衡細胞內、外壓力差，導致細胞內的水份外滲， 造成細胞生理缺水而降低生長速率或中止生長。澱粉是一種大分子的物質，在 水中溶解度低，不易形成高滲透壓現象，所以用玉米粉或薯粉做碳源養分時， 澱粉用量可提高到 5左右。氮源是構成細胞的主要物質，液體醱酵常用的氮 源物質有馬鈴薯抽出物、玉米漿、玉米粉、大豆粉、酵母粉等。其中以馬鈴薯
3、抽出物最適合牛樟芝菌絲體的生長，麥芽抽出物及酵母抽出物也是很好利用的 氮源。牛樟芝深層培養需要的金屬元素，主要是磷、鉀、鎂、鈣、鋅、硫等元 素的無機鹽，其中對磷、鉀、鎂的需要量最多。除磷元素外，牛樟芝對這些金 屬元素的要求只要培養基總量的百萬分之幾即可，由於需要量甚微，一般天然 培養基中所含有的微量元素已足夠其生長之用，不需要再另外添加。 (2) 牛樟芝深層醱酵對酸鹼度的要求 牛樟芝液體深層醱酵最適宜的酸鹼度為 pH 4.56，過酸或過鹼對菌絲生長 都不利。pH 值過低，菌絲粗且短，生長速度慢;pH 值過高，菌絲細且弱，菌絲 可用率低。牛樟芝菌絲在生長過程中會產生酸性物質，會使培養基 pH 下
4、降， 當培養基 pH 降至 3.5 以下時，菌絲就會停止生長，並開始產生自溶現象。菌絲 自溶後，細胞內含物會被釋放至培養液中，培養基 pH 就會上升，所以在醱酵 時，若發現 pH 有突然明顯上升趨勢時，就可能是菌絲已開始自溶，這時就要注意調整 pH 值或增加通氣量。由於醱酵過程中，培養基 pH 值會發生變化，所 以在醱酵時每隔一定時間(一般為四小時)就要測定一次 pH 值，當培養基 pH 值 急劇下降，就要用氨水或鹼液調節 pH 值，以維持最佳的成長環境。牛樟芝深 層醱酵的適宜溫度為 2530。醱酵時必須控制在最適合的溫度，當培養溫度 高於 30時，菌絲生長快速，但菌絲呈中空狀，而且容易自溶，
5、醱酵液的色澤 深，次級代謝物產率低。高於 35時，牛樟芝菌絲生長停止，超過 40以上時， 菌絲很快就會死亡。另一方面，當培養溫度低於 20時，牛樟芝菌絲生長趨緩， 但菌絲重量持續增加，這表示菌絲內有很多代謝物的累積。10以下時，則菌 絲停止生長，溫度回復 20後，菌絲又可可恢復生長。醱酵溫度對醱酵產物累 積也會產生影響。溫度高時，菌絲呼吸強度大，營養物質的消耗量多，醱酵產 物累積少；溫度低時，菌絲生長慢，營養物質的消耗少，醱酵產物累積量多。 但溫度低導致醱酵周期就延長，成本就會因此而提高。所以醱酵初期以菌絲生 長為主要考量，溫度可控制在 2530左右，五天以後，可將溫度適度調降到 20左右，使
6、菌絲體生長進入代謝產物累積階段，如此就可達到最佳的發酵模 式。 (3) 通氣量深層醱酵培養時，若醱酵液中溶氧量不能滿足牛樟芝菌絲生長的需要時， 將會嚴重影響菌絲生長。在醱酵初期（接種後的 6 小時內） ，醱酵液中菌絲量少， 菌絲對氧的需求量並不大。進入 12 小時以後，菌絲生長旺盛，對氧的需求量變 得非常高，此時需要將通氣量或攪拌速率加大，以增加溶氧量。這時醱酵槽通 氣量應控制到 0.51(v/v min)，即每一立方米的醱酵液中，每分鐘應通入無菌的 純淨空氣 0.51 立方米。醱酵後期，菌絲開始衰老，代謝能力下降，呼吸量也 降低，所以通氣量可適當減少，以減少冒泡現象。通氣時須一邊攪拌，使氣泡
7、 變得更小，在槽中的滯留時間更長，醱酵液中可溶解更多的氧氣。攪拌也可使 菌絲分布比較均勻，但攪拌速度不能太快，否則菌絲容易產生損傷，導致產量 的下降。 (4) 接種量和菌齡 液體深層醱酵培養時，菌絲生長速度與接種量有關。接種量多時，菌絲生 長快，牛樟芝在培養基中易形成優勢菌，雜菌感染率低。接種量少時，菌絲生 長慢，但長時間沒有足夠的牛樟芝菌絲時，抵抗力就會降低，容易感染雜菌。 醱酵用的菌種必須使用菌齡短、生命力旺盛、生長速度快的菌絲，這樣醱酵週期短，經濟效益高。年輕的菌種的生命力強，抗雜菌能力強。反之，若菌齡太 老、生命力弱、生長速度慢，感染雜菌的機會相對也就高。 (5) 無菌操作要求 牛樟芝
8、深層醱酵培養對無菌條件特別高，因培養液中營養成分十分豐富， 在不斷攪拌的條件下，一旦感染雜菌，整罐菌種即遭到汙染。由於細菌或黴菌 的生長速率比牛樟芝快很多，所以一旦感染雜菌就會造成醱酵失敗。因此，深 層醱酵必須做到雜菌防治工作。牛樟芝初期生長慢，可能受雜菌感染的環節相 當多，包括：受污染菌種，醱酵設備密閉性不足，培養基或醱酵槽滅菌不完全， 接種無菌操作不確實等等。防治牛樟芝醱酵雜菌汙染必須做到下列工作: (a) 原始菌種一定要純，接種前要仔細檢查，不得有疑似雜菌現象。菌種活化時 必須定時取樣以顯微鏡觀察，以確保菌種無雜菌污染。 (b) 菌種菌齡要短，生命力要強，接種量要夠。接菌後，菌絲在醱酵槽
9、中的遲滯 期短，生長迅速，待牛樟芝菌絲佔優勢後，雜菌即不易感染。 (c) 培養基原料要新鮮，不能有黴變現象。培養基中盡量不要有顆粒狀物，若有， 則過篩以去除大顆粒分子。 (d) 設備要經常檢修，閥門、墊片、管路不能有滲漏。接種口、進料口、空氣入 口、空氣出口密閉性要嚴格把關。 (e) 空氣過濾器不能受潮。醱酵通氣時過濾器內要始終保持正壓狀態，受潮的過 濾器內必須及時更換濾芯，以避免空氣過濾不完全。 (f) 接種操作要嚴格遵循無菌操作標準程序。 (g) 醱酵過程中隨時取樣分析，觀察醱酵液的色澤、透明度、氣味，酸鹼值。醱 酵結束時醱酵液應清澈、透明，有牛樟芝的特殊香味，但無黴味、酒味和臭 味等異味。若發現雜菌感染應立即終止醱酵，滅菌後排放並尋找汙染原因。
