报告基因技术的理论基础及其应用

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1、报 告 基 因 技 术 的 理 论 基 础 及 其 应 用刘 志 锋 姜 勇 第 一 军 医 大 学 病 理 生 理 学 教 研 室 和 全 军 休 克 微 循 环 重 点 实 验 室 , 广 州 巧摘 要 报 告 基 因 技 术 广 泛 地 应 用 于 监 测 细 胞 的 信 号 转 导 和 基 因 表 达 , 通 过 把 转 录 控 制 元 件 剪 接 到报 告 基 因 , 可 以 直 观 地 “ 报 道 ” 细 胞 内 与 基 因 表 达 有 关 的 信 号 级 联 。 这 种 检 测 具 有 敏 感 性 高 、 方 便 、可 靠 而 且 适 用 于 大 规 模 检 测 等 优 点 。

2、随 着 报 告 基 因 技 术 及 其 检 测 方 法 的 不 断 改 进 , 荧 光 素 酶 、 绿 色荧 光 蛋 白 以 及 新 近 克 隆 出 的 红 色 荧 光 蛋 白 作 为 无 害 性 的 检 测 工 具 , 将 在 检 测 活 体 组 织 和 细 胞 基 因表 达 方 面 得 到 越 来 越 广 泛 的 应 用 。 此 外 , 在 研 究 疾 病 发 生 的 分 子 机 制 , 基 因 治 疗 和 药 物 开 发 方 面 ,报 告 基 因 技 术 也 将 发 挥 出 重 要 作 用 。 本 文 对 报 告 基 因 技 术 的 基 础 理 论 、 常 用 报 告 基 因 的 种 类

3、 和 特点 , 以 及 其 目 前 的 主 要 应 用 作 了 概 括 性 介 绍 。关 键 词 报 告 基 因 荧 光 蛋 白 信 号 检 测 基 因 表 达学 科 分 类 号细 胞 外 刺 激 如 多 肤 、 类 固 醇 激 素 、 细 胞 因 子 和神 经 递 质 等 与 细 胞 表 面 或 细 胞 内 的 受 体 相 互 作 用可 引 发 一 过 性 信 号 , 激 活 一 系 列 转 录 因 子 后 , 最 终 使基 因 表 达 发 生 变 化 。 通 过 将 反 应 元 件 连 接 到 报 告 基因 , 然 后 有 选 择 地 检 测 报 告 基 因 表 达 产 物 即 可 检 测

4、到 相 应 信 号 级 联 反 应 的 活 性 及 它 们 在 细 胞 内 基 因 表达 和 调 控 方 面 的 作 用 。 报 告 基 因 的 种 类 很 多 , 其 应用 也 非 常 广 泛 , 从 基 因 表 达 的 时 间 、 空 间 控 制 到 受 体的 功 能 鉴 定 、 药 物 筛 选 , 以 及 到 基 因 运 送 系 统叮 等 都 有 涉 及 。一 、 报 告 基 因 技 术 的 理 论 基 础报 告 基 因 是 指 其 表 达 产 物 易 被检 测 , 且 易 与 内 源 性 背 景 蛋 白 相 区 别 的 基 因 。 报 告基 因 技 术 是 通 过 把 已 确 定 的

5、顺 式 调 控 序 列 剪 接 到 报告 基 因 上 来 控 制 基 因 的 活 性 , 这 些 反 应 元 件 可 以 对宿 主 细 胞 中 基 因 调 控 和 表 达 的 变 化 起 反 应 , 从 而 就可 以 直 观 地 “ 报 道 ” 细 胞 内 与 基 因 表 达 有 关 的 信 号级 联 。报 告 基 因 的 优 点 是 细 胞 内 背 景 活 性 低 , 而 且 可以 将 细 胞 表 面 的 信 号 放 大 , 产 生 一 个 高 敏 感 、 易 检 测的 反 应 。 报 告 基 因 的 选 择 依 赖 于 所 使 用 的 细 胞 系 和实 验 的 性 质 , 以 及 对 相

6、应 检 测 方 法 的 可 行 性 。 选 择报 告 基 因 的 准 则 包 括 报 告 分 子 应 不 存 在 于 宿主 中 或 易 于 和 内 源 性 基 因 相 区 别 应 该 有 一 个简 单 、 快 速 、 灵 敏 及 经 济 的 分 析 方 法 来 检 测 报 告 分子 报 告 分 子 的 分 析 结 果 应 具 有 很 宽 的 线 形 范围 , 以 便 于 分 析 启 动 子 活 性 的 幅 度 变 化 报 告 基因 的 表 达 必 须 不 改 变 受 体 细 胞 或 生 物 的 生 理 活 动 。二 、 报 告 基 因 的 类 型 及 特 点一 氯 霉 素 乙 酞 基 转 移

7、酶 氯 霉 素 乙 酞 基 转移 酶 , 作 为报 告 基 因 最 早 主 要 用 于 监 测 细 胞 基 因 的 转 录 活 性 。它 是 一 种 原 核 生 物 蛋 白 合 酶 的 抑 制 剂 , 可 使 乙 酞 基从 乙 酞 辅 酶 转 移 到 氯 霉 素 的 一 轻 基 位 。 这 种 酶性 质 稳 定 , 而 且 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 没 有 内 源 性 表 达 。但 是 , 其 检 测 必 须 依 赖 于 放 射 性 化 学 物 质 , 虽 然 自 动分 析 可 使 检 测 相 对 容 易 控 制 一 些 , 但 其 线 性范 围 和 灵 敏 性 仍 然 比 不 上 其

8、它 报 告 基 因 。二 一 半 乳 糖 昔 酶 一 半 乳 糖 昔 酶 是 一 种 细菌 酶 , 在 分 子 生 物 学 中 被 广 泛 用 于 监 测 和 校 正 转 染效 率 。 因 其 分 析 简 单 且 无 需 使 用 放 射 性 同 位 元 素 ,所 以 一 半 乳 糖 昔 酶 相 比 有 更 好 的 优 越 性 。 其原 有 的 简 单 的 色 谱 分 析 因 敏 感 性 低 , 线 性 动 态 范 围窄 而 被 更 加 敏 感 可 靠 的 生 物 或 者 化 学 发 光 检 测 所 代替 。 此 外 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 它 虽 然 有 内 源 活 性 表达 , 但

9、可 通 过 提 高 值 来 降 低 其 背 景 值 。三 分 泌 性 碱 性 磷 酸 酶 分 泌 性 碱 性 磷 酸 酶欲 , 是 胎 盘 碱 性 磷酸 酶 的 一 种 突 变 形 式 。 其 最 大 的 优 点 是 表 达 后 可 以从 细 胞 内 分 泌 到 细 胞 外 , 在 培 养 基 中 就 可 以 很 容 易检 测 到 , 因 此 , 可 以 保 持 细 胞 完 整 , 以 便 于 进 一 步 实国 家 杰 出 青 年 科 学 基 金 、 国 家 自 然 科 学 基 金、 以 资 助 课 题 “ 通 讯 作 者验 使 用 。 廉 价 的 比 色 测 定 也 已 经 被 自 动 的

10、化 学 发 光测 定 所 取 代 , 而 且 更 适 用 于 高 通 量 筛 选, 。四 荧 光 素 酶 荧 光 素 酶 是 一 类 能 够 催 化 不同 底 物 , 如 荧 光 素 或 腔 肠 素 发 生 氧 化 , 发 射 出 荧 光 的酶 。 作 为 报 告 基 因 分 析 , 最 常 用 的 荧 光 素 酶 是 细 菌荧 光 素 酶 、 萤 火 虫 荧 光 素 酶 和 最 近 发 现 的 花 虫 荧 光素 酶 。 细 菌 荧 光 素 酶 是 一 种 耐 热 的 二 聚 体 蛋 白 , 这就 限 制 了 它 作 为 报 告 基 因 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 的 应用 。 而 萤 火

11、 虫 荧 光 素 酶 因 为 其 敏 感 性 高 和 线 性 范 围宽 , 现 已 成 为 哺 乳 动 物 细 胞 中 最 常 用 的 报 告 基 因 。萤 火 虫 荧 光 素 酶 也 存 在 有 检 测 和 分 析 不 足 , 就 是 需要 裂 解 细 胞 , 而 后 还 要 加 人 荧 光 素 作 为 发 光 底 物 。针 对 这 些 缺 点 , 目 前 使 用 的 可 自 动 穿 透 膜 并 可 被 磷酸 化 的 萤 火 虫 荧 光 素 脂 , 则 可 以 避 免 裂 解 细 胞 。 此外 , 随 着 不 断 开 发 出 新 的 发 光 试 剂 , 也 使 其 发 光 反 应变 得 更

12、加 持 久 而 稳 定 , 以 至 于 可 以 用 发 光 计 数 器 来进 行 检 测 , 同 时 也 更 适 用 于 。 花 虫 荧 光 素 酶由 于 其 可 催 化 可 穿 透 细 胞 膜 的 腔 肠 素 氧 化 , 所 以 作为 报 告 基 因 其 主 要 用 于 检 测 完 整 的 活 细 胞 系 统 , 而且 其 在 哺 乳 动 物 细 胞 中 没 有 内 源 活 性 。五 绿 色 荧 光 蛋 白 从 维 多 利 亚 生 物 发 光 水母 中 分 离 出 来 的 绿 色 荧 光 蛋 白, , 在 无 需 任 何 辅 助 因 子 或 底 物 参 与 的情 况 下 即 可 自 动 发

13、射 出 荧 光 。 故 其 最 大 的 优 点 是 在无 需 裂 解 细 胞 的 情 况 下 , 就 能 检 测 活 体 组 织 和 细 胞的 基 因 表 达 , 而 且 安 全 无 害 。 自 从 年 基因 克 隆 以 来 , 已 经 有 多 种 突 变 体 问 世 , 有 蓝 绿色 荧 光 蛋 白 , 、 黄 色 荧光 蛋 白 , 和 蓝 色 荧 光蛋 白 , , 它 们 都 显 现 出优 于 野 生 型 的 特 性 闭 。六 红 色 荧 光 蛋 白 红 色 荧 光 蛋 白, 是 最 近 被 克 隆 出 的 一 个的 荧 光 蛋 白 , 作 为 一 种 潜 在 的 表 达 示 踪 剂 和

14、融 合 伴侣 , 已 经 引 起 了 广 泛 关 注 。 我 们 构 建 了 红 色 荧光 蛋 白 融 合 载 体 并 在 细 胞 中 进 行 表 达 , 结 果表 明 红 色 蛋 白 作 为 报 告 基 因 有 其 特 有 的 优 越 性 。和 以 前 的 报 告 蛋 白 相 比 , 其 除 了 具 有 可 自 动 发 出 荧光 、 高 的 性 噪 比 、 易 检 测 等 优 点 外 , 还 对 极 端 值及 光 漂 白 作 用 都 有 极 好 的 抗 性 。 但 是 , 也 存 在一 些 缺 点 , 如 其 强 的 四 聚 化 作 用 和 成 熟 慢 , 而 这 就 使其 在 细 胞 生

15、物 学 方 面 很 多 潜 在 的 应 用 都 受 到 限制 。一 种 新 的 会 随 时 间 改 变 颜 色 的 蛋 白 将 有 助 于 研究 者 们 监 测 完 整 的 有 机 体 中 基 因 表 达 的 活 化 或 抑制 。 及 其 同 事 培 养 出 的 “ 荧 光 计 时 器 蛋白 ” , 是 红 色 荧 光 蛋 白 的 一 个 变 种 , 它 可 以 从 鲜 绿 色变 成 黄 色 , 然 后 是 橙 色 , 最 后 变 成 红 色 。 他 们 将 这 种蛋 白 的 基 因 插 人 到 几 种 不 同 类 型 的 细 胞 中 , 使 它 处在 某 个 “ 启 动 子 ” 控 制 之

16、下 , 这 个 特 殊 的 启 动 子 可 以通 过 加 热 而 被 激 活 。 加 热 之 后 较 短 的 时 间 内 , 细 胞发 出 绿 色 的 荧 光 , 然 后 逐 渐 转 为 红 色 , 从 而 使 研 究 者可 以 方 便 、 快 速 地 了 解 到 基 因 转 录 的 适 时 信 息 。随 着 报 告 基 因 及 其 检 测 系 统 的 不 断 改 进 , 对 细胞 内 基 因 活 性 的 观 察 也 变 得 更 加 直 观 和 形 象 , 发 光和 荧 光 检 测 也 日 益 受 到 重 视 。 如 、 和 荧 光素 酶 等 无 害 、 高 敏 感 的 报 告 基 因 作 为 检 测 基 因 转 位和 表 达 的 手 段 , 目 前 受 到 众 多 研 究 者 的 青 睐 此 外 ,、 和 突 变 体 蛋 白 在 光 谱 特 性 和 信 号 强度 上 均 有 明 显 的 区 别 , 这 样 就 可 以 通 过 不 同 的 报 告蛋 白 来 同 时 监 测 细 胞 内 多 种 蛋 白 的 表 达 和 定 位 。三 、