显微镜成像质量

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1、影响显微镜成像的关键因素- 像差 由于客观条件，任何光学系统都不能生成理论上理想的像，各种像差的存在影响了成 像质量。所谓像差（aberration ） ，是指测量显微镜或者体视显微镜透镜或反射镜所呈的像 与原物面貌并非完全相同的现象。像差又可以分为几类，例如球面像差是由于一点光源发 散的光线被分聚在不同的点上的缘故。色彩像差的原因是透镜的折光指数随光波的长短而 变化，从而引起像的边缘呈现色彩。可以理解为实际像与根据单透镜理论确定的理想像的 偏离，这些偏离是折射定律造成的。像差是由透镜对色光的不同弯曲能力所致，并造成带 有色晕的像。与色无关的像差（“单色像差” ）包括使像变形的像差（“畸变”

2、、 “场曲” ） 和使像模糊的像差（“球差” 、 “彗差” 、 “散光” ） 。 像差在金相显微镜、数码 CCD、生物 显微镜和其他光学显微镜中可以通过透镜的组合减小到最低限度。镜面也有与透镜一样的 单色像差，但没有像差。色差（Chromatic aberration ）色差是透镜成像的一个严重缺陷，发生在多色光为光源的情况下，单色光不产生色差。 白光由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫七种组成，各种光的波长不同，所以在通过透镜时的 折射率也不同，这样物方一个点，在像方则可能形成一个色斑。色差一般有位置色差，放大率色差。位置色差使像在任何位置观察都带有色斑或晕环， 使像模糊不清。而放大率色差使像带有彩

3、色边缘。显微镜光学系统最主要的功能就是消色 差。球差（Spherical aberration）球差是轴上点的单色相差，是由于透镜的球形表面造成的。球差造成的结果是，一个 点成像后，不在是个亮点，而是一个中间亮边缘逐渐模糊的亮斑，从而影响成像质量。球差的矫正常利用透镜组合来消除，由于凸、凹透镜的球差是相反的，可选配不同材 料的凸凹透镜胶合起来给予消除。旧型号显微镜，物镜的球差没有完全矫正，应与相应的 补偿目镜配合，才能达到纠正效果。现一般生物显微镜、工业显微镜包括体视显微镜的球 差完全由物镜消除。慧差（Coma）慧差属轴外点的单色像差。轴外物点以大孔径光束成像时，发出的光束通过透镜后， 不再相

4、交一点，则一光点的像便会得到一逗点状，型如慧星，故称“慧差” 。使用轴向平行 光可以消除慧差。 像散（Astigmatism）像散也是影响清晰度的轴外点单色像差。当视场很大时，边缘上的物点离光轴远，光 束倾斜大，经透镜后则引起像散。像散使原来的物点在成像后变成两个分离并且相互垂直 的短线，在理想像平面上综合后，形成一个椭圆形的斑点。像散是通过复杂的透镜组合来 消除。场曲（Curvature of field）场曲又称“像场弯曲” 。当透镜存在场曲时，整个光束的交点不与理想像点重合，虽然 在每个特定点都能得到清晰的像点，但整个像平面则是一个曲面。这样在镜检时不能同时 看清整个像面，给观察和照相造

5、成困难。因此研究用显微镜的物镜（包括奥林巴斯显微镜、 尼康显微镜、蔡司显微镜等系列）一般都是平场物镜，这种物镜已经矫正了场曲。畸变（Distortion）前面所说各种像差除场曲外，都影响像的清晰度。畸变是另一种性质的像差，光束的 同心性不受到破坏。因此，不影响像的清晰度，但使像与原物体比，在形状上造成失真。 （1） 当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在像方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实像； （2） 当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在像方二倍焦距上形成同样大小的倒立实像； （3） 当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在像方二倍焦距以外形成放大的倒立实像； （4） 当物体位于

6、透镜物方焦点上时，则像方不能成像； （5） 当物体位于透镜物方焦点以内时，则像方也无像的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成 放大的直立虚像。 显微镜的成像原理就是利用上述（3）和（5）的规律把物体放大的。当物体处在物镜前 F-2F（F 为 物方焦距）之间，则在物镜像方的二倍焦距以外形成放大的倒立实像。在显微镜的设计上，将此像落在目 镜的一倍焦距 F1 之内，使物镜所放大的第一次像（中间像） ，又被目镜再一次放大，最终在目镜的物方 （中间像的同侧） 、人眼的明视距离（250mm）处形成放大的直立（相对中间像而言）虚像。因此，当 我们在镜检时，通过目镜（不另加转换棱镜）看到的像与原物体的像

7、，方向相反。 如今的显微镜在物镜设计上已经逐步设计出了平场消色差物镜、半复消色差物镜、甚 至全复物镜，对于显微镜成像质量给了很好的保证 影响显微成像质量的因素- 显微镜镜头 显微镜镜头分不同类型，但即使对于同一类型的镜头，其成像质量也有着很大的差异，这 主要是由于材质、加工精度和镜片结构的不同等因素造成的，同时也导致不同档次的镜头 价格从几百元到几万元的巨大差异。比较著名的如四片三组式天塞镜头、六片四组式双高 斯镜头。对于镜头设计及生产厂家，一般用光学传递函数 OTF(Optical Transfer Function) 来 综合评价镜头成像质量，光学系统传递的是亮度沿空间分布的信息，光学系统

8、在传递被摄 景物信息时，被传递之各空间频率的正弦波信号，其调制度和位相在成实际像时的变化， 均为空间频率的函数，此函数称为光学传递函数。OTF 一般由调制传递函数 MTF(Modulation Transfer Function)与位相传递函数 PTF(Phase Transfer Function )两部分组成。 像差是影响图像质量的重要方面，常见的像差有如下六种： 球差: 由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后，若原光束不 同孔径角的各光线，不能交于主轴上的同一位置，以至在主轴上的理想像平面处，形成一 弥散光斑( 俗称模糊圈)，则此光学系统的成像误差称为球差。

9、慧差: 由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系列折射后， 若在理想像平面处不能结成清晰点，而是结成拖着明亮尾巴的慧星形光斑，则此光学系统 的成像误差称为慧差。 像散: 由位于主轴外的某一轴外物点，向光学系统发出的斜射单色圆锥形光束，经该光学系列折 射后，不能结成一个清晰像点，而只能结成一弥散光斑，则此光学系统的成像误差称为像 散。 场曲: 垂直于主轴的平面物体经光学系统所结成的清晰影像，若不在一垂直于主轴的像平面内， 而在一以主轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则此光学系统的成像误差称为 场曲。当调焦至画面中央处的影像清晰时，画面四周的影像模糊;而当调焦

10、至画面四周处的 影像清晰时，画面中央处的影像又开始模糊。 色差: 由白色物体向光学系统发出一束白光，经光学系统折射后，各色光不能会聚于一点上，而 形成一彩色像斑，称为色差。色差产生的原因是同一光学玻璃对不同波长的光线的折射率 不同，短波光折射率大，长波光折射率小。 畸变： 被摄物平面内的主轴外直线，经光学系统成像后变为曲线，则此光学系统的成像误差称为畸变。畸变像差只影响影像的几何形状，而不影响影像的清晰度。这是畸变与球差、慧差、 像散、场曲之间的根本区别。 我们在评价镜头质量时一般还会从分辨率、明锐度和景深等几个实用参数判断。 分辨率： 又称鉴别率、解像力，指镜头清晰分辨被摄景物纤维细节的能力

11、，制约镜头分辨率的原因 是光的衍射现象，即衍射光斑(爱里斑) 。分辨率的单位是线对/ 毫米。 明锐度(Acutance) ： 也称对比度，是指图像中最亮和最暗的部分的对比度。 景深(DOF)： 在景物空间中，位于调焦物平面前后一定距离内的景物，还能够结成相对清晰的影像。上 述位于调焦物平面前后的能结成相对清晰影像的景物间之纵深距离，也就是能在实际像平 面上获得相对清晰影像的景物空间深度范围，称为景深。 最大相对孔径与光圈系数： 相对孔径，是指该镜头的入射光孔直径( 用 D 表示)与焦距(用 f 表示) 之比，即：相对孔径 =D/ f 。相对孔径的倒数称为光圈系数(aperture scale)

12、，又称为 f/制光圈系数或光孔号码。 一般镜头的相对孔径是可以调节的，其最大相对孔径或光圈系数往往标示在镜头上，如 1:1.2 或 f/1.2 。如果拍摄现场的光线较暗或曝光时间很短，则需要尽量选择最大相对孔径较大 的镜头。 镜头各参数间的相互影响关系 一个好的镜头，在分辨率、明锐度、景深等方面都有很好的体现，对各种像差的校正也比 较好，但同时其价格也会几倍甚至上百倍的提高。如果我们掌握一些规律和经验，就可以 使用同档次的镜头达到更好的效果。 1. 焦距大小的影响情况 焦距越小，景深越大; 焦距越小，畸变越大; 焦距越小，渐晕现象越严重，使像差边缘的照度降低; 2. 光圈大小的影响情况光圈越大

13、，图像亮度越高; 光圈越大，景深越小; 光圈越大，分辨率越高; 3. 场中央与边缘 一般像场中心较边缘分辨率高 一般像场中心较边缘光场照度高 4. 光波长度的影响 在相同的摄像机及镜头参数条件下，照明光源的光波波长越短，得到的图像的分辨力越高。 所以在需要精密尺寸及位置测量的视觉系统中，尽量采用短波长的单色光作为照明光源， 对提高系统精度有很大的作用。 * （1）显微镜的主要性能 分辨力：也称分辨本领，是指区分两个物点之间的最小距离的能 力。能把两点分辨开的最小距离叫分辨距离。分辨距离越小，则分辨力越高；相反则低，所以，分辨力以分辨距离来表示。一般肉眼 的分辨距离为 0.25mm 左右，所以比

14、这个距离小的两点会被误看成 一点。显微镜也有它的分辨距离和分辨力，这是显微镜性能中最重 要的指标，它主要由物镜性能所决定。显微镜的分辨距离跟照明光 的波长和物镜镜口率有关，可以用如下公式表示： 分辨距离（R）0.61/ NA ：照明光波长 NA：物镜镜口率 从上式可见：照明光波越短，物镜镜口率越大，分辨力越高。 一般可见光的彼长范围为 400700nm，若使用镜口率为 1.25 油镜， 用可见光中最短波长的紫色光，则分辨距离约为 0.2m，这是一般 光学显微镜分辨力极限。用高速电子束（其波长短到 0.005nm）作 为电子显微镜照明，分辨力可达 0.2nm 左右。比光学显微镜分辨力 提高 10

15、00 倍。 镜像亮度：镜像亮度与物镜镜口率平方成正比，与总放大倍数成 反比，即镜口率越大，镜像亮度越大；总放大倍数越高，镜像亮度 越小。所以，总放大倍敢相同情况下，要使镜像亮度增加，就应使 用镜口率的物镜与低倍目镜配合。例如：总放大倍数都是 200 倍， 则用镜口率为 0.65 的 40物镜与 5目镜配合，其镜像亮度比使用 镜口率为 0.25 的 10物镜与 20 目镜的镜像亮度高 6.75 倍。因目 镜放大倍数过大，得到的放大虚像很不清晰。 视野宽度：目镇光柱所围绕的圆即视野宽度，视野宽度越大，观 察标本的面积越大，则显微镜放大倍数越小。所以，视野宽度与放大率成反比。因此，当将低借物镜转换成高倍物镜时，必须先把标 本移到视野正中央。否则玻片标本的影像会落到缩小视野的外面。 清晰度：清晰度是指显微镜能形成明显物像的能力，影响物像清 晰度的主要是物镜，由于照明光的光谱不同，造成色差和透镜本身 球面像差。放大倍数越高，像差越大，像就越模糊。