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1、毕业论文：橄榄叶等植物来源黄嘌呤氧化酶抑 制剂活性研究 题目：橄榄叶等植物来源黄嘌呤氧化酶抑制剂活性研究 院（系） 化工学院 专 业 生物工程 橄榄叶等植物来源黄嘌呤氧化酶抑制剂活性研究 摘要 摘要：【目的】检测筛选橄榄叶等植物来源的活性成分对黄嘌呤 氧化酶的抑制作用。【方法】采用酶反应速率法测定样品对酶活 性的抑制能力大小。【结果】在橄榄叶粗提物及其过色谱柱层析 分离后的组分中，发现脂溶性粗提物总体上比水溶性粗提物效 果好。11月份的抑制活性最高，其半数抑制浓度为253.25g/mL ，而当样品经过过柱分离纯化后，其中的小分子组分半数抑制 浓度仅为72.34g/mL，抑制活性增加了3.5倍。
2、在9种中草药粗 提物中，发现水溶性粗提物抑制效果总体优于脂溶性粗提物。 其中葛花，猫须草，金 银花三种药材的粗提物抑制效果最好，葛 花的半数抑制浓度为647.17mg/mL ，在三种水溶性粗提物中抑 制效果最佳。对橄榄叶11月甲醇粗提物，过柱分离后的粗提物， 葛花、猫须草水溶性粗提物做抑制类型检测，发现所有样品均 为以竞争性抑制为主的复合抑制类型。【结论】从橄榄叶等植物 来源的成分对黄嘌呤氧化酶都有较好的抑制效果，尤其橄榄叶 的抑制效果明显优于另外9种中药，这为研究开发新的抗痛风 药物开拓了新的视野和方向，为进一步分离纯化药效物质提供 了参考。 关键词：橄榄叶；中草药；黄嘌呤氧化酶抑制剂；半数
3、抑制浓度； 抑制类型。The research of inhibitory ability of xanthine oxidase inhibitors from olive leaves and other plant sources Abstract Abstract:Objective Detect and screen active ingredients of xanthine oxidase inhibitor from olive leaves and other plant sources . MethodsAssay the enzyme reaction rate to e
4、stimate the activity of the samples inhibitory ability. Results Having the components of olive leaves crude extracts and the ones after the Chromatographic column chromatography separation, we found that the effect of inhibition of fat-soluble crude extracts are higher （新文秘网http:/省略1853字，正式会员可 完整阅读）
5、 3 实验方法 2 2.3.1溶液配置 2 2.3.2检测方法 2 第3章 结果与讨论 2 3.1样品粗提物抑制率检测筛选方法的建立与优化 2 3.1.1反应体系体积比的优化 2 3.1.2反应体系底物浓度优化 2 3.1.3 反应操作条件优化 2 3.1.4 黄嘌呤氧化酶浓度优化 2 3.2实验结果 2 3.2.1橄榄叶活性组分粗提物初筛结果 2 3.2.2中草药活性组分粗提物初筛结果 2 3.3.3 橄榄叶活性组分粗提物半数抑制浓度 的计算 2 3.3.4 中草药水溶活性组分粗提物半数抑制浓度 计算 2 3.3.5样品抑制类型判定 2 3.3结果分析及讨论 2 3.3.1 橄榄叶粗提物结果
6、讨论 2 3.3.2 中草药粗提物结果讨论 2 3.3.3 抑制类型结果讨论 2第4章 结论和展望 2 4.1 结论 2 4.2 展望 2 参考文献 2 致谢 2 第1章 绪论 1.1 概述 1.1.1黄嘌呤氧化酶概述 黄嘌呤氧化酶( Xanthine Oxidase , XOD) ， EC1232，是一种黄素蛋白酶, 专一性不高，既能催化次黄嘌呤生成黄嘌呤，进而生成尿酸，又 能直接催化黄嘌呤生成尿酸的酶，同时产生过氧化物自由基， 是体内核酸代谢中重要的酶，黄嘌呤氧化酶催化反应如下： 次黄嘌呤 + O+ 黄嘌呤 + 黄嘌呤 + O + 尿酸 + 黄嘌呤 + O + 2 尿酸 + 2 + 2 它
7、存在于牛乳、动物特别是鸟类的肝脏与肾脏、昆虫、细菌中。 分子量10几万30几万。其底物专性较广，除以嘌呤衍生物为 电子供体外，还可以蝶啶衍生物、醛（生成羧酸）为电子供体，表面上生成羟基化合物，氧原子来源于水。NADH也氧化。电子受 体很多，有分子氧、硝酸盐、苯 醌、硝基化合物、NAD 、铁氧还蛋白等，但依 酶的来源而有所不同。在反应时生成过氧 化物，引起连锁反应。黄嘌呤氧化酶的晶体结构已经被解析1, 它由1 330个氨基酸构成,由两个完全对称的结构单元构成。每一个结 构单元为145 ku ,其催化中心包括一个钼蝶呤(Molybdopterin , Mo2pt) 中心、两个铁2硫中心(Iron2
8、suL Furcenters , Fe/ S ,) 和一个黄素腺嘌呤二核苷酸(FLavin Adenine DinucLeotide , FAD) ,其中钼蝶呤中心是黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤生成尿酸的关键 位点。尿酸浓度过高将导致高尿酸血症, 可引起痛风发作，自由基涉及到炎症等一系列病理过程。抑制 黄嘌呤氧化酶的活性, 既可以减少体内尿酸的形成, 有效地阻止或延缓痛风及其并发症, 又可以减少自由基造成的组织伤害。 1.1.2黄嘌呤氧化酶抑制剂概述 黄嘌呤氧化酶抑制剂作为抗痛风药物,从上世纪60 年代上市的别嘌呤醇,到后来的丙磺舒、苯溴马隆，以及秋水仙 碱，都有很好的治疗作用。 其中别嘌呤醇通过抑
9、制黄嘌呤氧化酶的活性,减少黄嘌呤向尿 酸的转化,从根本上减少体内尿酸的生成,从而达到治疗痛风的 作用,自1963年用于临床以来,一直是一线抗痛风药。然而,应用 后病人可能有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板 减少等症状,甚至有肝功能损害等副作用。因此,研究新的黄嘌 呤氧化酶抑制剂具有十分重要的意义。一些天然植物及中草药 中富含丰富的黄酮类化合物及其他活性成分, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、抗心脑血管疾病等多种药理 作用，且根据已有的研究结果，这些活性成分对于黄嘌呤氧化 酶具有很好的的抑制效果,使得植物和中草药来源的活性成分在研发黄嘌呤氧化酶抑制剂新药中颇具前景。2 1.1.3 橄
10、榄叶研究现况 近年来，国内外对橄榄的研究主要集中在木犀科(OLeaceae)木 犀榄属(OLea L) 的欧橄 榄( 木犀榄)OLeaeuropaea L3 。长期以来，人们一直从橄榄油中提取有效活性成份， 发现从橄 榄油中得到的活性组分能够有效抑制黄嘌呤氧化酶的活性4， 然而，生物学家发现，橄榄叶含有的抗氧化活性成份较之橄榄 油更为突出(高100倍)，尤其是橄榄苦苷(oLeuropein)和黄酮类 化合物在叶中的含量明显高于果实和树皮。现代生物分析研究 表明5，欧橄榄叶中活性物质主要有橄榄多酚、黄酮类、裂环 烯醚萜类(包括橄榄苦苷)、双黄酮等。在地中海地区，橄榄叶也 被作为一种常用药物来治疗
11、痛风。从橄榄叶中可以分离提取得 到多种有效成分，其中一种名为黄酮糖苷芹黄素的成分对黄嘌 呤氧化酶的抑制活性最高，他的抑制剂常数Ki为0.52M，效果 甚至高于常用黄嘌呤抑制剂别嘌呤（Ki为7.3M）。橄榄多酚裂 环烯醚萜类化合物是橄榄叶的主要提取物（24.8%），虽然其抑 制剂常数Ki 达到了50.3M，但仍有较为明显的抑制活性。根据 Dixon图和Lineweaver Burk曲线，橄榄多酚的抑制类型为竞争性抑制，而其他样品均 表现出复合型抑制特征6。本文研究的橄榄为橄榄科橄榄属植 物。福建作为我国橄榄的主要产区之一，传统生产上以收获果 实为主，并将其作为药、食两用植物。 1.1.4 从中草
12、药中提取黄嘌呤氧化酶抑制剂的研究现况 别嘌呤醇作为一线抗痛风药物，有着很好的治疗效果，但是同 时伴有较多的副作用。近年来一些研究发现2，黄酮类化合物 广泛存在于中草药中, 具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌、抗心脑血管疾病等多种药理 作用。根据已有研究7，发现串果藤（甘草素与异甘草素）8、 葛花、黄柏、猫须草、金银花、绞股蓝、迷迭香9等中草药对黄嘌呤氧化酶有很好的抑制活性。其中，金银花作为我国常用中 药，应用历史悠久，中医 临床上将含有金银花的方剂用于痛风 疾病的治疗，现代研究报道金银花水提物及甲醇提取液可抑制 黄嘌呤氧化酶活性10。根据现有研究结果11，金银花的乙醇 粗提物对黄嘌呤氧化酶的抑制能
13、力较好，半数抑制浓度为48.8 mg/mL ，进一步分离纯化得到的样品半数抑制浓度减小为35.2mg/mL ，并且该样品可以有效减少体内血清中的尿酸盐水平，经过生 物活性向导分离，从金银花中成功分离出了一种黄酮类化合物 忍冬黄酮，该成分对黄嘌呤氧化酶的抑制效果惊人，半数抑制 浓度仅有0.85mg/mL ，另有研究结果证明12，金银花对黄嘌呤 氧化酶的抑制活性甚至在受到伽马辐照后仍不会改变，所有这 些结果都表明，金银花在治疗痛风方面有着很大的潜力。另有 对卷柏的研究，发现它的提取物具有很强的直接清楚自由基的 活性，同时又能较强的抑制黄嘌呤氧化酶和脂质氧化酶的活性 13。 这些都给抗痛风新药开发很
14、多提示和启发，中草药来源的 黄嘌呤氧化酶抑制剂,毒性低且来源广泛,在有效阻止和延缓痛 风、高尿酸血症等疾病方面显示了良好的应用前景。 1.2 实验原理 1.2.1黄嘌呤氧化酶酶活力测定原理 黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下生成尿酸，产物尿酸在波 长290nm处有特征吸收峰，故在290nm处用分光光度计发测定， 每隔5秒在290nm处记录吸光度及吸光度增长的数值，共计5min 。在任意一个适当长的时间段内，吸光度随时间呈线性增加，斜 率为反应速率，斜率越大，说明酶的活力越强。14, 15 1.2.2抑制类型判断原理 用Dixon作图法可以判断抑制类型并可得到抑制剂常数。以抑 制剂浓度I 为横坐标
15、 ，以1/v 为纵坐标，采用一个以上的S浓度， 画出不同S时的直线，这些直线交点的横坐标即为Ki。直线交点在第二象限X轴，为非竞争性抑制；直线交点在第二象限，为 竞争性抑制；两直线平行不相交，为反竞争性抑制。16 1.3 研究目的和意义 目前，从植物来源寻找抗痛风新药的研究正备受关注，本实验 通过筛选多种植物来源药材，测量其对黄嘌呤氧化酶的抑制率 及抑制类型，旨在发现高效低毒的的黄嘌呤氧化酶抑制剂新药 。 第2章 材料与方法 2.1试剂与仪器 2.1.1试剂与药品 药品名称 规格 甲醇 工业纯 重蒸使用黄嘌呤 Sigma公司 黄嘌呤氧化酶 Sigma 公司 别嘌呤醇 Sigma公司 EDTA-
16、2Na 分析纯 分析纯 分析纯 2.1.2实验仪器 仪器名称 规格 电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司 DKZ-2型电热恒温振荡水槽 上海精宏实验设备有限公司 超声波清洗机 宁波荣顺科技仪器厂 RE52CH-1旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 酶标仪 河南省华仪器有限公司 SpectraMAX190 南京华东电子集团医疗装备有限责任公司 2.2实验材料 2.2.1.橄榄叶不同组分粗提物 来自同组实验同学的实验结果，分别采集不同月份的橄榄叶分 别用蒸馏水和甲醇浸泡，经过浓缩处理得到水溶性和脂溶性组 分粗提物，经过D- 101大孔吸附树脂分离纯化,得到22种共24种不同活性组分的样 品，具体情况如表2-1所示。 表2-1. 橄榄叶提取物编号含义 橄榄叶样品编号 粗提物处理方式 橄榄叶样品编号 粗提物处理方式 1 1月甲醇 11 1月水溶 2 2月甲醇 12 2月
