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1、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（ MALDI-TOF-MS）技术2002年诺贝尔化学奖发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析田中耕一 【 日】约翰 贝内特 芬恩【 美 】MALDI技术离子化技术： MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/ IonizationMALDI技术的原理 样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜 激光照射，基质吸收能量 基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。质谱分析原理进样系统 离子源 质量分析器 检测器1.气体扩散2.直接进样3.色谱1.电子轰击2.化学电离3.场
2、致电离4.激光 1.单聚焦 2.双聚焦 3.飞行时间4.四极杆 基质辅助激光解吸电离 (MALDI)基本原理：基本原理：将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样 , 当用激光当用激光 (337 nm的氮激的氮激光或光或 355 nm的固体激光器的固体激光器 )照射晶体时照射晶体时 , 基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品
3、分子带上正电荷或负电荷，成形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。为带电荷的离子。离子源特点离子源特点 :1、使用脉冲式激光；、使用脉冲式激光；2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系；数有一一对应关系；3、离子化效率高，灵敏度高、离子化效率高，灵敏度高 (fmol amol)常用基质：芥子酸 (3,5-二甲氧基 -4-羟基肉桂酸 )（ SA)、龙胆酸 (2,5-二羟基苯甲酸 )(DHB)、 - 氰基 -4-羟基肉桂酸 (CHCA)、
4、吡啶甲酸 (PA)、 3-羟基吡啶甲酸 (3HPA)。MALDI技术中基质的作用l 把样品分子彼此分开 (基质：样品 =10， 000： 1)，削弱样品分子之间的相互作用。l 基质 吸收 激光的 能量， 并将部分能 量 传递给样品。l 帮助样品离子化。基质是如何帮助样品分子电离的？以正离子模式为例： 基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分释放给样品分子 帮助样品分子质子化，並帶有电荷（ M+H+） M+H+ 在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在高压电场的吸引下 M+H+ 离开离子源飞向飞行管Matrix - CHCA常用基质及选择基质 样品HCCA 蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物
5、DHB 蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA 核苷酸Dithranol 非极性聚合物IAA 非极性聚合物 E=Uz=1/2mv2 和 t=L/V E： 离子在加速电场获得的动能 ; U： 加速电场电压 z： 离子所带电荷 ; m： 离子质量 v： 离子飞行速度 ; L： 飞行管道长度 t： 离子飞行时间 ; c： 常数 质量分析范围： 500Da-100KDaMALDI-TOF质谱 的原理t = c m/zPulsed laser3. 多肽离子在 TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的 M/Z的大小 Flight tube1：基质与多肽样本共同置于刚靶上。High vacuumTimeH
6、igh voltage2. 样本被激光电离形成多肽离子混合物 。20 - 25 kV5. 检测到每个离子的 M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段 M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。4. 到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的 M/Z.1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤LaserMALDI-TOF-MS线性模式检测SampleplateAnalytemolecules in matrixAccelerationgridsDrift tube Ion detectorMass spectrumVacuum systemVacuuml
7、ock几秒钟即可得到结果 MALDI-TOF 质谱的特点 软电离质谱碎片少 检测质量范围宽 400kDa 灵敏度高 fmol 分析速度快自动化 数据容易解释 可以测试混合物 可以测试高分子 仪器容易使用、维护triggerdiodelaservariableattenuator250 l/sturbo 250 l/sturbo3.4 m reflector1.8 m linearMALDI TOF MS的构成检测器 1：线性模式检测器 2：反射模式线性模式和反射模式反射模式（ linear）1. 一般测试分子量小于 4000的样品2. 分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（ reflection
8、）1. 一般测试大分子量样品（M4000）2. 分辨率低，得到是平均分子量的质荷比反射模式下 TOF的分辨率高于线性模式Bruker公司仪器示意图ABI公司仪器示意图岛津公司仪器示意图DetectorHelium collision cell for fragmentgenerationIon gate forparent ionselectionPulsed LasergeneratesMALDI ions20 KeVMALDI IonSourceMALDI-TOF质谱的应用应用 MALDI-TOF-MS技术鉴定和分类微生物待检样品克隆选择样品制备质谱分析数据分析菌种鉴定?Bacillus
9、globigiiProfiling results from different Bacillus strains-6000-4000-20000200040006000a.i.B. globigiiB. licheniformisB. subtilisB. thuringiensis实验流程Result Report | Detected Species | Ranking |act Sc |max Sc |Rel Score |PN k |PN b |PN m |Rel P-Num.|I-Corr.|1000*Pro-Spectrum #12 | Ps. mendocina DSM5001
10、7 | 1 | 3813 | 4271 | 0.89 | 41 | 10 | 83 | 0.55 | 0.88 | 438| Ps. oleovorans B396 | 2 | 1671 | 3450 | 0.48 | 14 | 8 | 83 | 0.22 | 0.39 | 41| Ps. fluoreszens B340 | 3 | 868 | 4186 | 0.21 | 6 | 7 | 83 | 0.11 | 0.19 | 4| Ps. veronii DSM11331 | 4 | 847 | 4250 | 0.20 | 5 | 7 | 83 | 0.10 | 0.14 | 3| Ps.
11、putida DSM291 | 5 | 374 | 2821 | 0.13 | 3 | 3 | 83 | 0.05 | 0.12 | 1| Ps. putida B401 | 6 | 329 | 2638 | 0.12 | 3 | 2 | 83 | 0.05 | 0.11 | 1基于谱图模式比对的细菌鉴定应用软件 BIOTYPER细 菌鉴定结果的报告MALDI-TOF-MS技术鉴定微生物优势l速度快 ，操作简单l结果不受生长培养基影 响，结果不受细菌生长状态影响l重复性 ,稳定性好。 (在标准条件下进行样本制备和测量后，在不同的 MALDI-TOF仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性 。 )l高通量，成本低。建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库l取得微生物标准品的单克隆样品l样品进行 MALDI-TOF MS分析得到标准品质谱l建立多种常规检测目标微生物质谱数据库l未知样品通过 MALDI-TOF-MS分析得到质谱l未知样品质谱进入建立好的质谱数据库进行比对l快速准确得到微生物鉴定结果质谱数据库质谱数据库未知样品未知样品match目前 MALDI-TOF-MS在微生物鉴定中的应用 医学临床微生物 食品工业微生物 动植物检疫微生物MALDI-TOF-MS技术在动植物检验检疫的前景 前沿性 实用性
