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1、质谱定量的原则系列讲座（转自分析测试百科叮当空间）质谱定量的原则 01-目录：1质谱定量的简介a) 总离子流b) 选择离子监测（SIM）c) 选择反应监测（SRM/MRM）2开发一个 SRM 方法3内标4PK/LC/MS/MS 药物代谢动力学的 LC/MS/MS 的反相液相色谱的方法开发5样品制备6标准和标准曲线的准备a) 做标准曲线的步骤b) 标准曲线的稀释方案 Scheme 的举例c) 标准曲线的运行d) 进行标准品和样品的随机化e) 系统运行的实用性f) “QCs”质量控制7相关的 PK 资源8定量的技巧 Tips质谱定量的原则 02质谱定量的简介和 LC/MS 监测的模式简介本教程主要
2、用于：使用质谱作小分子药代动力学分析，即 PK/MS。除此之外，这些同样的原则也可用于生物基质中肽和蛋白的定量。传统上，在使用现代质谱定量之前，定量是用 HPLC 高效液相色谱和 UV 紫外检测器实现的。HPLC 药代动力学分析建立在保留时间、峰面积和紫外光谱性质的基础上的。HPLC 方法的缺点是灵敏度不够、缺乏特异性。我们已经看到一些实例，一个化合物的确已经代谢了，然而保留时间和紫外光谱上，母离子和代谢物无法区分。这种缺少特异性的分析时不时会误导研究者。所以在药代动力学分析中，基于质谱的表征现在是一种新型的重要的工具。质谱定量中已经被广泛接受的方式是 MS/MS 定量。这种定量常通过三级四极
3、杆或离子阱质谱实现。要求使用 MS/MS 的原因是：许多化合物有同样的质量。当使用第一个维度即单级质谱 MS 去定量时，也会缺乏特异性，尤其是对于像血液那样的复杂的基质。第二个维度的 MS（即 MS/MS）在大多数情况下，能够提供唯一的断裂。合并特异的母离子质量和唯一的碎片离子信息，可以选择性地监测被定量的化合物。下面我们将讨论获得和可视化 LC/MS 数据的方法。获得和可视化 LC/MS 的数据，或称为：质谱数据如何在一个 LC/MS 实验中表达？典型的方法，质谱被设置为扫描特定的质量范围。在全扫描分析中，质量扫描范围较宽；在选择离子监测 SIM 时，质量扫描范围较窄。依赖于扫描的类型，一个
4、独立的质量扫描时间可以从 10 ms 到 5 秒。在一次 LC/MS 分析中可获得许多个扫描。LC/MS 数据的表示方法为：把每个质量扫描的离子流信息叠加，画出随时间变化的总离子流，横轴是时间，纵轴是强度。总离子流图非常像HPLC 的紫外图，见图 1。下面我们将讨论各种扫描的模式，和这些模式同质谱定量的关系。最常见的 LC/MS 数据模式为：（1） 总离子流图（2） 选择离子监测（SIM）（3） 选择反应监测（SRM）或多反应监测（MRM）：MRM 和 SRM 本质上是同样的实验模式。 全扫描分析图 1 从药代分析中得到的全质量范围的总离子流图（TIC）非常像 HPLC UV 图，除了：质谱能
5、检测到更多的化合物，尤其是没有紫外吸收的化合物。总离子流是一个叠加图，叠加了每个质量扫描的离子流。当一个小分子或小肽流出 HPLC色谱柱时，相对强度上升，在 TIC 图上出现了一个峰，横轴是时间。每个质量的化合物都被记录在 TIC 图上。找出感兴趣的化合物可能是困难的，因为许多化合物有相同的质量。化合物的天然质量不是鉴定的唯一性数据。设置一个确定的质量，可以画出一个提取离子流图，但这个图的强度会比下面介绍的 SIM实验中的强度低。（注意：TIC 指的是在一段时间内采集的质量扫描数据，不特指扫描范围或质谱实验的类型。例如，我们可以在 SIM 或 SRM 实验中获得 TIC 图。然而，为简单起见，
6、我们将把这些图称为 SIM 和 SRM 图，而不是 SIM TIC 图。）Selected Ion Monitoring 选择离子监测 在选择离子监测中，质谱被设置为扫描一个非常小的质量范围，典型的是一个质量数的宽度。选择的质量宽度越窄，SIM 的确定度越高。SIM 图就是从非常窄的质量范围中得到的离子流图。只有被该质量范围选择的化合物才会被画在SIM 图中。图 1 和图 2 是同一个样品的谱图，然而它们看起来很不相同。原因是在 SIM 图中，画的是 TIC 图中较少的组分。SIM 图是比 TIC 图更确定的图。图 2然而，SIM 图仍显示了许多峰，不能唯一地确认我们感兴趣的化合物。一个复杂的
7、样品（比如血清或血浆）中，这样的图是一个典型的 SIM 图。许多化合物有同样的质量，在 ESI 中还有多电荷峰也和我们感兴趣的化合物有同样的 m/z值。SIM 实验比全扫描实验更灵敏，因为质谱在一个更小的质量范围上驻留（dwell）更长的时间。Selected Reaction Monitoring 选择反应监测 （SRM）SRM 被大多数科学家在质谱定量中使用，见图 3。 SRM 中，可以监测一个特征的唯一的碎片离子，在很多非常复杂的基质中进行定量。SRM 图非常简单，通常只包含一个峰。这种特征性使 SRM 图成为灵敏度高且特异性强的理想的定量工具。图 3SRM 的过程：选择一个特征的母离子
8、做 MS/MS，在其碎片中选择一个特征的子离子作为监测离子。可以把 SRM 理解为碎片离子的 SIM。这种特征性的实验被成为“transition” （跃迁），可以表示为：母离子 子离子，举例：534 375质谱定量的原则 03建立一个 SRM Transition 534 375一个定量分析方法应该是特征性的、高准确度和高灵敏度的。在不牺牲上述特性的前提下，建立方法应该尽可能地快速，质谱定量可以很好地满足这些规则。在建立一个感兴趣的化合物的 MS/MS 碎片 transition 的时候，一种优化transition 的方法是用注射泵进样（syringe pump）该化合物来优化。先在全扫描
9、方式中优化母离子信号。因为 MS/MS 的灵敏度将依赖于化合物在全扫描模式中是否响应得好，要尽可能地优化全扫描的、非 CID 响应的 MS 信号。然后优化碰撞能 CE 和碰撞气体，给出丰度最高的碎片离子。不能使用太大的碰撞能 CE，因为太大的 CE 会丢失稳定的、有价值的碎片峰。“我应如何优化碎片峰？”可以用注射泵进样化合物，进行 MS/MS，挑出一个稳定的碎片峰，当改变碰撞能和碰撞气体参数时监测它的离子流。最后当获得最大的碎片离子峰响应时确定碰撞能和碰撞气体参数。现代的三重四极杆质谱都可以自动优化。从优化好的 MS/MS 谱中，选择一个合适的碎片峰用于定量监测。如图 A 所示，母离子质量为
10、534，似乎从图 B 中可以很容易选择一个碎片峰做 Transition。一个基本考虑是尽可能不要选择离母离子太近的质量。非常常见的，是化合物的失水峰或失氨（ammonia ）峰，例如：53451717。我们应尽可能不要选择失水峰或失氨（ammonia ）峰做 SRM，因为这会导致一个不是很特异的transition。这里，Transition 534 375 是一个好的选择。另外要注意的是：要选择一个稳定的峰。当直接进样化合物时，被选择做 Transition 的峰必须每次扫描响应都一致。提示：当优化 MS 条件时，最好能模拟实际做样的条件。例如：实际做样时色谱流速是 400 ul/min，
11、化合物在 30%有机相时流出，用注射泵进样优化 MS 条件时最好模拟这个条件，即设置 HPLC 流速为 400 ul/min，30%有机相；然后用三通注入化合物。同时，第一次优化实验时，我们可以选择 60/60 的梯度，去表征化合物的疏水性，从而得知它在 C18 反相柱上的色谱行为。如果你对所有的化合物都按这样的方法实验，你就可以建立一个洗脱数据库，可以作为将来实验的参考。注： 60/60 梯度的意思是：梯度从近 100% 水相开始，在 60 分钟内到达 60%有机相。质谱定量的原则 04内标 在做 MS 定量时应该使用内标。选择一个合适的内标，将能减少因为样品提取、HPLC 进样和离子化的多
12、样性造成的差异。在复杂基质的分析中，在 SRM 积分图上，在标准曲线的低端，常会见到：两个不同的浓度水平，会给出近乎一致的响应。只有当使用一种内标时，这两个点才能被区分。一些研究者试图在实验中不用内标去做标准曲线，但成功率不高。我们在标准曲线上每个浓度水平都重复进样 3 次。没有内标的情况下，重现性RSD 常常会高于 20%；而当使用内标时，%RSD 能降低到近 2%。我要如何选择一个内标?最好的内标是待定量的化合物的同位素内标。同位素标记的内标将和待测物有相似的回收率、ESI 离子化响应，和相似的色谱保留时间。如果你运行的不是临床药代动力学定量，可能很难判断上述说法，因为特殊的合成一个同位素
13、标记的内标，是非常昂贵和耗时的。通常，如果你和一个医学的化学家工作，他们会有一个化合物相似物库，可以被用作内标。这些类似物，在化合物合成中被测试，和该化合物性质相似可以被用户定量内标，而且更重要的是，这些类似物和该化合物的母离子质量有微小的差异。尽量不要使用去甲基化（14）或者是氧化的（16）的类似物作内标，因为待测化合物的母离子常会发生同样的代谢。常见的做内标的类似物是氯代的化合物。氯代的化合物类似物会和待测化合物有相似的色谱保留时间，这是内标的一个重要特性。我们已经发现内标物的一个最重要的特性是它和待测化合物共流出。我该如何使用内标？首先，内标添加需在样品测试方法的开始阶段，典型的，应在血
14、浆 crash 或固相萃取之前。内标应用同一浓度水平添加（包括标样） 。内标应给出可靠的质谱响应。应该注意的是：内标的量应添加得合适，应高于定量限，但不能过高，因为过高的内标响应会抑制被分析物的离子化。 “我应该添加多少量的内标？” 这是一个重要的问题。通过做一些试分析：早、中、晚的时间点，也许一个或两个标准点，你应该知道你的样品中化合物的大概量。这些信息非常有价值，可以帮助建立一个合适的标准曲线，并知道应添加多少量的内标。举例来说：如果待定量的样品浓度范围是 100 fg 25 pg，检测限是 100 fg，你应该添加510 pg 的内标。一个好的经验法则是：内标物的量大概是标准工作曲线浓度
15、最高点的 1/3。这将给出一个比较不错的响应，并且不会抑制和干扰待测样品的离子化。见图 1图 1 内标的量（内标.gif）质谱定量的原则 05液相色谱串联质谱联用药代动力学方法开发更快就是更好！在每一个药代动力学分析中更快就是更好！样品组/系列包括：重复的标准品，QC 质控样品，和样品，加起来大概要进行300 次分析。如果每个样品实验耗时 15 分钟，整套分析要 75 个小时。高要求的实验（加上质谱）总计要超过 3 天时间。一些该领域的研究者可以只花 12分钟分析一个样品；而大多数的 PK/MS 的实验室一般很容易做到花 34 分钟分析一个样品。如果对上面同样的 300 个样，4 分钟一个实验
16、的话，总分析时间可减少到 20 个小时。所以，每分钟都是很重要的！在 2mm 3050mm 反相短柱上可以获得快速的梯度和快速的平衡时间。LC/MS 的非药动实验中，流速一般为 200 l/min.，而在 LC/MS 的药动实验中，流速一般设为 400 1000 l/min。更快的流速有助于加速洗脱和平衡。下面是典型的 LC/MS 药动实验条件：LC/MS 药动实验方法：色谱柱：2.1 X 50 mm, 5 m , 100 , C18柱温： 40流动相：A 为水相（0.1% 甲酸），B 为乙睛（0.1%甲酸）流速： 400l/min梯度： Time(min.) %B0252802.125425Notes：a ) 调节初始的B 使其适应该化合物 b ) 试着减少梯度时间到 1 分钟以缩短方法时间 优化梯度：当然你要对每个化合物特别的进行
