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1、牛乳中细菌数的检查摘 要：【目的】采用两种方法检测牛乳中细菌数目，鉴定牛乳卫生等级。 【方法】采用美蓝还原酶试验法和标准平板计数法检测不同种类牛乳中细菌数目，确定质量等级。通过对照试验鉴定巴斯德消毒法是否符合卫生标准。 【结果】美蓝还原酶试验法可以快捷简便地对牛乳质量等级进行定性检测；标准平板法可以对牛乳中细菌数量进行定量检测，结果准确。 【结论】通过标准平板法平行测定，可确定样品牛乳等级为中等和差。通过对照试验，确定巴斯德消毒法可靠性强。关键词：牛乳；美蓝还原酶；标准平板计数；细菌数；检查The Inspection of the Number of Bacteria in MilkYong
2、qing Xue, Wenjing Sun, Xiangchen Fan, Na Li, Junyi Li, Hongzhou Zhao, Tongyang Chen, Chunyan Hu(College of Life Sciences, Shandong Agricutual University, Taian, 271000, China)Abstract: ObjectiveUsing two methods to detecting the quality of cows milk and the number of bacteria in milk and to dentifyi
3、ng the hygienic level of milk. Methods Using the methylene blue reductase method and the standard plate counting method to carry on the detection of the number of bacteria in different milk, therefore to determine the quality of milk. Through controlled trails to determine whether Pasteurization of
4、milk meets the quality standards. Results Methylene blue reductase test method can be easy and quick for the qualitative detection of milk quality levels; while standard plate counting method can quantify the number of bacteria in milk and the results of the test are commonly accurate. Conclusion Me
5、asured by the standard plating count method, the milk samples being determined are at a middle and some even low level. By the controlled trials to determine that Pasteurization is reliable.Key words: the cows milk; the methylene blue reductase method; the standard plate counting method; the numble
6、of bacteria; inspection1 引言牛乳富含蛋白质，长期饮用有助于增强体质。同时，牛乳也是许多疾病传播的一种重要的非生命载体，富含微生物生长繁殖的丰富营养 1。从健康母牛体内刚取出的牛奶含有少量正常的起始微生物，在牛乳的采取、加工、分装与运输过程中，可能由于操作不规范而使牛乳污染杂菌。由于牛乳营养丰富，其中污染的杂菌会快速繁殖，饮用后对身体有极大危害。牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、美蓝还原酶试验、检测大肠菌群和标准平板计数法 2，本次试验通过后两种方法分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是否达标
7、。2 材料与方法2.1 试验时间与地点 2011 年 11 月 7 日-8 日，9 号楼 522 试验室。2.2 试验材料 材料：亚奥特鲜牛奶；亚奥特纯牛奶；牛肉膏蛋白胨培养基；试剂：美蓝溶液（1:250 000） ；无菌水；蒸馏水等；仪器和用具：试管，试管架，三角瓶，5mL 移液枪及枪头，1mL 移液枪及枪头，培养平板，高温蒸汽灭菌锅，恒温水浴锅，微波炉，显微镜，载玻片，标记笔等。2.3 试验方法2.3.1 牛肉膏蛋白胨培养基和无菌水的制备与灭菌制备牛肉膏蛋白胨培养基 400mL，分装在两个三角瓶中；取 9 支试管，每支试管加9mL 蒸馏水。将牛肉膏蛋白胨培养基与装有蒸馏水的试管及 21 个
8、平板一起灭菌，121维持 20min。牛肉膏蛋白胨培养基的配方（每 1000mL）为：牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl5g，琼脂 4.4g，水 1000mL，pH=7.07.2。2.3.2 美蓝还原酶试验法测定牛乳质量（1）取三支无菌试管，标记为 1 号、2 号和 3 号，1 号试管加入 10mL 亚奥特鲜牛奶，2 号、3 号试管分别加入 10mL 亚奥特纯牛奶，1 号、2 号试管分别加入 1mL 美蓝溶液，分别加棉塞塞紧。（2）轻轻摇动试管，置于 37水浴锅中温浴，记录开始时间；（3）试管在水浴锅中稳定 5min 后取出，轻轻摇动后再放回水浴锅；（4）每隔 30min 取出试管观察美蓝
9、与牛乳混合液颜色变化，直至 3-6h，记录试管中牛乳 4/5 变白时的时间。2.3.3 巴氏消毒法消毒牛乳（1）将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；（2）取一支无菌试管，标记 A，加亚奥特鲜牛奶 5mL；（3）将 A 试管置于 80水浴锅中，使水面超过试管内牛乳液面，保持 15min，不断摇动试管使加热均匀；（4）加热至 15min 时立即取出试管，用流水冲洗试管外壁，使牛乳迅速冷却；2.3.4 标准平板计数法检测牛乳中细菌数（1）将亚奥特鲜牛奶摇匀，使其中的微生物充分混匀；（2）取一支无菌试管，标记 B，加亚奥特鲜牛奶 5mL；（3）摇匀 A、B 试管中牛乳，从 A 试管中吸取 1m
10、L 牛乳用无菌水稀释，稀释度依次为 10-2， 10-3， 10-4；从 B 试管中吸取 1mL 牛乳用无菌水稀释，稀释度依次为 10-3，10 -4，10 -5。（4）取 21 个无菌平板并标明稀释度、溶液名称（消毒前牛乳、消毒后牛乳和无菌水），其中分别取不同梯度的牛乳各 1mL 依次注入相应标记的平板，每个梯度做三个平行；取无菌水 1mL 注入平板，做三个平行；（5）取出灭菌后的牛肉膏蛋白胨培养基，用微波炉熔化为液体，冷却到 45左右后摇匀，向 21 个平板中各加 15mL，静置。（6）待平板中培养基凝固后倒置，置于 37培养箱中培养 24h；（7）选择菌落数为 30-300 左右的平板计
11、数，计算每毫升牛乳中细菌数。3 结果与分析3.1 试验结果3.1.1 美蓝还原酶试验法结果见表 1。表 1 美蓝还原酶试验法结果Table1 the results of methylene blue reductase test1 号试管 2 号试管 3 号试管还原时间/min 95 185 牛乳等级 差 中等 注：表格中“”表示无数据。3.1.2 标准平板计数法结果见表 2。表 2 标准平板计数法结果Table2 the results of the standard plate counting method溶液 10-2 10-3 10-4 10-5 每毫升牛乳中细菌数1 87 10
12、12 83 12 1消毒后 牛乳3 86 10 098331 2 消毒前 牛乳3 1 2 无菌水3 注：表格中“”表示未获得数据。3.2 分析3.2.1 美蓝还原试验法1 号试管还原时间为 95min，所以牛乳质量为“差” ；2 号试管还原时间为 185min，故牛乳质量为“中等” 。3 号试管未加美蓝溶液，作为观察颜色变化的对照。3.2.2 标准平板计数法1mL 巴氏消毒法消毒之后的牛乳中根据三个梯度测得的细菌数为 9833 个/mL 。说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒后才可饮用。未经消毒的牛乳未长菌落，具体原因见讨论部分。4 讨论美蓝还原酶试验法和标准平板技术法是牛乳中细菌数检测中较为准确、
13、直观的方法。其中，美蓝还原酶试验法可以定性检测牛乳质量。其原理是，美蓝作为一种氧化还原指示剂，可在厌氧条件下被还原为无色，如果牛乳中有细菌，其中的活的好氧和兼性厌氧菌通过呼吸作用消耗氧气，造成牛乳中溶氧下降，形成厌氧环境，氧化-还原点位降低，使美蓝还原为无色美蓝 34。牛乳中细菌数越多，呼吸作用越旺盛，消耗氧气越多，厌氧环境越严格，还原时间越短，因此可依据还原时间的长短判断牛乳的质量等级。目前通过美蓝还原法检测牛乳质量的一般标准是：还原时间在 30min 之内的，质量为 “很差” ，为四级奶；还原时间为 30min-2h 的，质量为“差” ，为三级奶；还原时间为 2-6h 的，质量为“中等”为
14、二级奶；还原时间为 6-8h 的，质量为“好”为一级奶 5标准平板菌落计数法是测定细菌数的经典方法，可以定量检测牛乳中细菌数量，从而直接判断牛乳质量。该方法依据的原理是单个细菌在合适的培养条件下可长成菌落，通过系列稀释使细菌浓度降低，并可以充分分散为单个细菌，经合适培养后，每个细菌都长成肉眼可见的菌落。待菌落长成后，通过统计菌落数并计算每毫升牛乳中的细菌数，从而判断牛乳的质量。我国消毒牛乳的卫生标准是，用标准平板计数法检查，规定细菌总数小于30000 个/mL 6。巴斯德消毒法是牛乳进行消毒普遍采用的方法，在牛乳分装之前消毒生奶，确保细菌相对较少，能消灭牛奶中的病原菌和有害微生物，但不破坏牛奶
15、的营养成分，并保持其物理性质，多用于食品消毒，保持食品风味。巴斯德消毒法是一种温和的加热工艺，在实际应用中加热消毒的范围较广，一般在 6390之间视消毒时间而定，主要方法有：63保持 30min，或者是 80保持 15min，90保持 5min。本次试验即验证了该消毒方法的消毒效果，通过在 80下保持 15min 然后用标准平板计数法检查细菌数，验证了巴斯德消毒法的可靠性，也说明生鲜牛乳必须经过巴斯德消毒法才符合卫生标准的要求，才能分装、饮用。在本次试验中仍出现了一些问题，主要表现在以下方面：第一，在美蓝还原酶试验中，未验证美蓝溶液是否变质失效。美蓝溶液变质后可能会影响还原时间的长短，甚至无法
16、测得实验数据。第二，在美蓝还原酶试验中，检查美蓝是否变色的时间间隔设定为 30min，使得试验结果可能存在较大误差。但缩短时间后，就意味着需要频繁取出试管，对温水浴效果有影响。根据本次试验的结果，在尽量缩小误差且不影响温水浴效果的前提下，建议将时间间隔缩短为 15min。由于时间原因，本次试验并未验证 15min 的时间间隔是否确实符合试验要求。第三，在标准平板计数法测细菌数试验中，在试验设计初，没有设置空白对照，即用1mL 无菌水代替消毒后和消毒前的牛乳，加 15mL 左右牛肉膏蛋白胨培养基，在相同条件下培养，进行菌落计数。只有通过空白对照试验，才能确定无菌水、培养基、操作过程、操作中使用的仪器是否染菌，是否对试验结果有影响。根据严格的试验要求，应设置该对照试验，并且只有在对照组中严格不长菌落的前提下才能确保整个操作过程属于无菌操作。第四，在标准平板计数法测定细菌数试验中，在试验设计初，未消毒牛乳细菌数测
