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1、博士德免疫组化 SABC 法与 SV 法的比较发布时间：2011-12-08 22:38 点击次数： 186 免疫组化 SABC 法与 SV 法的比较 SABC 法：ABC 代表的是亲和素生物素过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）就是 StreptAvidin Biotin Complex 的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。基本原理：亲和素（Avidin）存在于鸡蛋中，分子量 67000。是一种碱性蛋白质，具有对生物素近乎于共价键的结合力。链
2、霉亲和素是一种从链霉菌（Streptomyces Avidinii）培养物中所提取的蛋白质，分子量 47000，不含糖链，等电点 IP=6.0-6.5。和亲和素一样，也有四个生物素结合位点，亲和力高达 10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。现在经过改进的亲和素等电点 IP 可以达到 7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非特异性吸附。生物素是一种水溶性维生素（即维生素 H），分子量 244。生物素活化后，可以标记抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素酶复合物可以起到放大信号的作用，这是 SABC 具有高度敏感性的基础。SV（Super Vision）两步法：是用聚合标记方法将过氧化物
3、酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体- 酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强大的信号放大能力，同时有很强的组织细胞渗透力，经检测其灵敏度高于同类产品，特别是针对核抗原，其渗透性特别强，适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法比较具有简单，快速，高敏感，低背景等特点。原理示意图：用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物现对这两种方法进行比较：一材料所选试剂：即用型 SABC（过氧化物酶）试剂盒（博士德货号 SA1021，SA1022）即用型 SV（HRP 辣根过氧化物酶）试剂盒（博士德货号 SV0001，SV0002 ）DA
4、B（黄色，博士德货号 AR1022）Mayors 苏木素（博士德货号 AR0005）所选一抗：KCA3.1（BA1788）； PCNA（BM0104 ）； Vimentin（ BM0135）注：抗体来源均为博士德公司所选组织片：乳腺癌石蜡切片，肠癌石蜡切片，切片厚度为 5 微米二操作步骤SABC 法：1.切片脱蜡至水2.新鲜配置 3%H2O2,室温 10 分钟, 灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗 2 分钟三次3.微波修复：将切片放入盛有 PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置分钟，拿出室温冷却分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加 5%BSA 封闭液
5、,37反应 30 分钟。甩去多余液体 ,不洗5.滴加一抗，4反应过夜。所配一抗的浓度为 1g/ml6.PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）洗 1分钟3 次，滴加生物素化二抗 IgG（抗兔或抗鼠）37 反应 30 分钟7.PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）洗 1分钟3 次，滴加试剂 SABC，37 反应 30 分钟，PBS 洗 3分钟3 次8. DAB 室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤9. 滴加苏木素轻度复染 60 秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和 Na2HPO4 溶液中 2 分钟，取出后洗涤，恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。SV 法：1.切片脱蜡至水2.新鲜配置 3%H2O2,室温 10 分钟，
6、灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗 2 分钟三次3.微波修复：将切片放入盛有 PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热煮沸，微波炉中静置分钟，拿出室温冷却分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却4.滴加 5%BSA 封闭液，37 反应 30 分钟。甩去多余液体，不洗5.滴加一抗，4反应过夜，所配一抗的浓度为 1g/ml6.PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）洗 1分钟3 次，滴加 HRP 标记二抗 IgG （抗兔或抗鼠）37反应 30 分钟，PBS 缓冲液（PH7.2-7.6）洗 30 分钟3 次7.DAB 室温显色,镜下控制反应时间 ，蒸馏水洗涤8. 滴加苏木素轻度复染 60 秒
7、，蒸馏水洗涤后浸入饱和 Na2HPO4 溶液中 2 分钟，取出后洗涤，恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。三.结果比较 四结论SABC 法的特点：1.稳定性好：链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍，二者结合形成复合物的解离常数很小。因此，SABC 法在实际应用中，稳定性高，减少了操作误差，提高了检测的精确度2.特异性高：链酶亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度特异性。因此，SABC 法的多级放大作用不仅可以提高检测的灵敏度，同时还避免了非特异性干扰3.高敏感性：生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成生物素衍生物结构，该结构具有保持大分子物质的原生物活性功
8、能，同时，每个链酶亲和素分子有四个生物素结合部位，可以多价形式同时结合生物素化的大分子衍生物和酶标记物。因此，SABC 法具有多级放大作用，使其在免疫组化实验时大大地提高检测方法的灵敏度SV 法的特点：1.背景染色低：由于不用亲和素，避免了内源性生物素干扰，减少了假阳性、降低了背景染色2.操作简便快速：仅需进行两次抗体孵育，更为简单、快速3.核抗原染色强：多聚酶紧密连接在免疫球蛋白分子上，由于没有惰性多聚物骨架总体分子量相对较小，克服了大分子复合物穿透力弱、核抗原不易染色的缺点4.敏感性较高：显色结果可以达到比较满意的效果总结上述特点，SABC 法与 SV 法各有优势，可根据自身的实验条件选取合适的实验方法
