呼吸道九联检sop

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1、文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 呼吸道九联检操作程序、呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分 为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染（acute upper respir tract infection），指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性 别、 职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下 呼 吸

2、道 感 染 是 最 常 见 的 感 染性 疾 患 ，包 括 急 性 气 管 支气管炎、 慢 性 支 气 管 炎 、肺 炎 、支 气 管扩 张 等 ，由 病 毒 、细 菌 、支 原 体 、衣 原 体 、军 团 菌 等 微 生 物 引 起 ，其防治应遵循预 防 为 主 、准 确 诊 断 、及 时 治 疗 的原则，治 疗 时 必 须 明 确引 起 感 染 的 病原体以 选 择 有 效 的 抗 生 素 。、免疫荧光法介绍免 疫 荧 光 技 术 （Immunofluorescence technique ）又 称 荧 光 抗 体技 术 ，是 标 记 免 疫 技 术 中 发 展 最 早 的 一 种 。它

3、是 在 免 疫 学 、生 物 化学 和 显 微 镜 技 术 的 基 础 上 建 立 起 来 的 一 项 技 术 。很 早 以 来 就 有 一些 学 者 试 图 将 抗 体 分 子 与 一 些 示 踪 物 质 结 合 ，利 用 抗 原 抗 体 反 应进 行 组 织 或 细 胞 内 抗 原 物 质 的 定 位 。Coons 等 于 1941 年 首 次 采 用荧 光 素 进 行 标 记 而 获 得 成 功 。这 种 以 荧 光 物 质 标 记 抗 体 而 进 行 抗原 定 位 的 技 术 称 为 荧 光 抗 体 技 术 （fluorescent antibody technique）。用 荧 光

4、抗 体 示 踪 或 检 查 相 应 抗 原 的 方 法 称 荧 光 抗 体 法 ；用 已文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 知 的 荧 光 抗 原 标 记 物 示 踪 或 检 查 相 应 抗 体 的 方 法 称 荧 光 抗 原 法 。这 两 种 方 法 总 称 免 疫 荧 光 技 术 ，因 为 荧 光 色 素 不 但 能 与 抗 体 球 蛋白 结 合 ，用 于 检 测 或 定 位 各 种 抗 原 ，也 可 以 与 其 他 蛋 白 质 结 合 ，用于 检 测 或

5、定 位 抗 体 ，但 是 在 实 际 工 作 中 荧 光 抗 原 技 术 很 少 应 用 ，所以 人 们 习 惯 称 为 荧 光 抗 体 技 术 ，或 称 为 免 疫 荧 光 技 术 。用 免 疫 荧 光技 术 显 示 和 检 查 细 胞 或 组 织 内 抗 原 或 半 抗 原 物 质 等 方 法 称 为 免 疫荧 光 细 胞 （或 组 织 ）化 学 技 术 。荧 光 免 疫 法 按 反 应 体 系 及 定 量 方 法 不 同 ，还 可 进 一 步 分 做 若 干种 。与 放 射 免 疫 法 相 比 ，荧 光 免 疫 法 无 放 射 性 污 染 ，并 且 大 多 操 作简 便 ，便 于 推 广

6、 。该 技 术 的 主 要 特 点 是 ：特 异 性 强 、敏 感 性 高 、速 度快 。主 要 缺 点 是 ：非 特 异 性 染 色 问 题 尚 未 完 全 解 决 ，结 果 判 定 的 客观 性 不 足 ，技 术 程 序 也 还 比 较 复 杂 。但 近 年 来 发 展 了 几 种 特 殊 的 荧光 免 疫 测 定 ，已 经 很 好 改 善 了 这 些 缺 点 ，与 酶 免 疫 测 定 和 放 射 免 疫分 析 一 样 ，应 用 在 临 床 检 验 中 。1原 理 免 疫 学 的 基 本 反 应 是 抗 原 -抗 体 反 应 。由 于 抗 原 抗 体 反 应 具 有 高度 的 特 异 性

7、，所 以 当 抗 原 抗 体 发 生 反 应 时 ，只 要 知 道 其 中 的 一 个 因素 ，就 可 以 查 出 另 一 个 因 素 。免 疫 荧 光 技 术 就 是 将 不 影 响 抗 原 抗 体活 性 的 荧 光 色 素 标 记 在 抗 体 （或 抗 原 ）上 ，与 其 相 应 的 抗 原 （或 抗 体 ）结 合 后 ，在 荧 光 显 微 镜 下 呈 现 一 种 特 异 性 荧 光 反 应 。其 根 据 反 应 体系 的 不 同 可 分 为 ：直 接 法 ：将 标 记 的 特 异 性 荧 光 抗 体 ，直 接 加 在 抗原 标 本 上 ，经 一 定 的 温 度 和 时 间 的 染 色 ，

8、用 水 洗 去 未 参 加 反 应 的 多余 荧 光 抗 体 ，室 温 下 干 燥 后 封 片 、镜 检 。间 接 法 ：如 检 查 未 知 抗 原 ，先 用 已 知 未 标 记 的 特 异 抗 体 （第 一 抗 体 ）与 抗 原 标 本 进 行文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 反 应 ，用 水 洗 去 未 反 应 的 抗 体 ，再 用 标 记 的 抗 抗 体 （第 二 抗 体 ）与 抗原 标 本 反 应 ，使 之 形 成 抗 原 抗 体 抗 体 复 合 物

9、，再 用 水 洗 去 未 反应 的 标 记 抗 体 ，干 燥 、封 片 后 镜 检 。如 果 检 查 未 知 抗 体 ，则 表 明 抗原 标 本 是 已 知 的 ，待 检 血 清 为 第 一 抗 体 ，其 它 步 骤 的 抗 原 检 查 相 同 。根 据 抗 原 抗 体 反 应 后 定 量 方 法 的 不 同 可 分 为 ：荧 光 抗 体 技 术 (荧 光显 微 镜 技 术 )：抗 原 抗 体 反 应 后 ，利 用 荧 光 显 微 镜 判 定 结 果 的 检 测 方法 。免 疫 荧 光 测 定 技 术 ：抗 原 抗 体 反 应 后 ，利 用 特 殊 仪 器 测 定 荧 光强 度 而 推 算 被

10、 测 物 浓 度 的 检 测 方 法 。2.荧 光 物 质 许 多 物 质 都 可 产 生 荧 光 现 象 ，但 并 非 都 可 用 作 荧 光 色 素 。只 有那 些 能 产 生 明 显 的 荧 光 并 能 作 为 染 料 使 用 的 有 机 化 合 物 才 能 称 为免 疫 荧 光 色 素 或 荧 光 染 料 。所 用 荧 光 物 质 介 绍 ：异 硫 氰 酸 荧 光 素 （fluoresceinisothiocyanate，FITC）：为 黄 色 或 橙黄 色 结 晶 粉 末 ，易 溶 于 水 或 酒 精 等 溶 剂 。分 子 量 为 389.4，最 大 吸 收光 波 长 为 490 4

11、95nm，最 大 发 射 光 波 长 520 530nm，呈 现 明 亮 的黄 绿 色 荧 光 ，有 两 种 同 分 异 结 构 ，其 中 异 构 体 型 在 效 率 、稳 定 性 、与 蛋 白 质 结 合 能 力 等 方 面 都 更 好 ，在 冷 暗 干 燥 处 可 保 存 多 年 ，是 应用 最 广 泛 的 荧 光 素 。其 主 要 优 点 是 ：人 眼 对 黄 绿 色 较 为 敏 感 ，通 常 切 片 标 本 中 的 绿 色 荧 光 少 于 红 色 。、呼吸道九联检产品介绍九 项 呼 吸 道 感 染 病 原 体 IgM 抗 体 检 测 试 剂 盒 ，采用间接免疫荧光法（IFA ），同 时

12、检测人血清中呼吸道感染主要病原体的 IgM 抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清 1 型、肺炎支原体、Q 热立克次体、文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2 和 3 型。用于呼吸道感染疾病的辅助诊断。1.检测原理间接免疫荧光法（IFA）（ 图 1）是基于待测样 本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在

13、下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果。图 1：九项呼吸道感染病原体 IgM 抗体检测试剂盒检测原理文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 2. 试剂盒组成及用途组分 成分和用途载玻片 检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测物的特异性抗原，包装袋内有一袋硅胶以防潮。质控品 用于证明试剂盒及试验的有效性，含有人血清及防腐剂。吸附剂 羊抗人 IgG 用来吸附人 IgG 避免干扰 IgM 检测，含有防腐剂。FITC 结合

14、物荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，含有染色液、防腐剂和蛋白稳定剂。和抗原抗体复合物反应，并显色。封闭介质 甘油缓冲液，便于观察。磷酸盐缓冲液(PBS)用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球蛋白和结合物。3. 操作步骤3.1 实验前准备1）实验所需物品准备：1000ml 量筒、1000ml 烧杯、离心管、微量移液器、温育湿盒、洗瓶、水平摇床、恒温箱、盖玻片、荧光显微镜。2）PBS 洗液的准备：将 1 瓶 PBS 粉末倒入烧杯中，加入 1L 蒸馏水中，摇匀直至完全溶解，配好后储存在 2-8C 备用。3）使用前，将所有试剂平衡至室温，将恒温箱调至 37。文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳

15、市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 3.2 实验步骤1）样本的稀释：按 1:1 比例稀释血清标本，即 25L 血清加入 25L PBS中。阴阳性对照不需要稀释。2）用吸附剂处理稀释后的血清：将 30L 稀释 后的血清加入 150L 吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照不需吸附剂处理。处理后的血清要离心 10-15 分钟除去沉淀，以防干扰检测。3）在载玻片的每孔中加 15L 吸附剂处理过 的血清。在一个载玻片的每孔中加入 15L 不稀释的阳性对照，在另一个 载玻片的每孔中加入 15L 不稀释的阴性对照。4）

16、将载玻片放入湿盒中，37温育 90 分钟。5）用 PBS 洗液的缓慢水流冲洗载玻片（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS 中并放置在水平摇床上轻轻摇动 10 分钟。将载玻片用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。6）载玻片自然晾干。7）每孔加入 15L FITC 结合物溶液（不需稀释）。8）将载玻片放入湿盒，37温育 30 分钟。9）重复 6 和 7 的洗涤步骤。10）加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。11）尽快用荧光显微镜在 400 倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于 2-8C 不超过 24 小时。文件编号：JYYY-3-WS-06贵阳市第二人民医院检验科 微生物作业指导书版本/修订号：A/0生效日期：20110517主题内容 呼吸道感染病原体九联检操作程序第 页 4结果判断4.1 有效性判断每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观 察到