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1、流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27 测定3：CD55CD59 测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞 T 细胞亚群细胞内因子 IFN-/IL-4 测定9：XL 操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第 1 版(共 3 页)本规程每 2 年复审一次复审日期： 年 月 日复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日文件分发部门和或个人院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 淋 巴 细 胞 亚 群 测 定(CD系 列 )方法 流式细胞仪(Be
2、ckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T 淋巴细胞：CD3+；B 淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性 T 淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性 T 淋巴细胞：CD3+CD8+；NK 细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上 CD 分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理受检者的准备 检查对象
3、生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1样本量至少 1ml。 2样本应在采集后 6 小时内处理，冷冻的标本不能用。3样本白细胞计数应在 4.0-10.0109/L 之间。若10.0109/L， 样本需要稀释，用 PBS 稀释；若10.0109/L， 样本需要稀释，用 PBS 稀释；若97% CD5997%PNH 的临界值：RBC CD5995% WBC CD5990%PNH 的诊断值：RBC CD5991% 大部分80% 中性粒细胞 CD5984% 临 床 意 义用于 AA 和 PNH 的诊断和分型诊断。PNH 时 CD55 和 CD59 明显
4、减低和缺如。方 案 （ Protocol）血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪)医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第 1 版(共 2 页)本规程每 2 年复审一次复审日期： 年 月 日复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日文件分发部门和或个人院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 血 小 板 膜 表 面 抗 体 测 定方法流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC 标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的 IgG-Fc 片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行
5、分析。 标本采集与处理受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA 或肝素抗凝血 要求 1样本量至少 1ml。 2样本应在采集后 6 小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。3样本血小板计数应在 150-450109/L 之间。若450109/L， 样本需要稀释，用 PBS 稀释；若10.0109/L，样本需要稀释，用 PBS 稀释；若10.0109/L， 样本需要稀释，用 PBS 稀释；若10.0109/L， 样本需要稀释，用 PBS 稀释；若4.010 9/L，应分离单个核 细胞。4溶血样本不能用。试剂淋巴细胞培养体系(自配) 成分：刺激素
6、PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640 液。选白美国 SIGMA 公司。单克隆抗体 CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC 选自美国 BeckmanCoulter 公司。质控品 BEKAMANCOULTER 产品，未开瓶的试剂于 2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于 2-8可稳定 2 周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 细胞培养与染色取 200ul 抗凝血加入 lOul CD4-PC5 单抗，室温避光孵育 30 分钟，RPMIl640 洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C0 2
7、37孵育 18 小时，取出后以 PBS 洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人 IL-4-PE 和 IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光 20 分钟，PBS 洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热 20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测 50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析 CD4 阳性细胞中 IL-4-PE 和 IFN-FITC 的表达。淋巴细胞在 FSSSC 散点图中位置，即 A 门内细
8、胞；A 门内 CD4 阳性细胞，即 B 门内细胞；B 门内 TH 细胞亚群分布：1 区数值-Th 1 细胞 (%)4 区数值-Th 2 细胞 (%)2 区数值-Th 0 细胞 (%)报告结果 报告百分数操作性能精密度 批内五次重复 CV2 灵敏度 5001000 个荧光素分子 正常参考值Thl(IFN-)：17.395.52% Th2(IL-4)：1.500.44%ThO ：0.510.26% 临 床 意 义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl 细胞主要分泌 IL-2，IL-12 ，IFN- 和TNF-ba 等， Th2 细胞主要分泌 IL-4IL-5IL-6，IFN- 为 Thl 最特异分泌的
9、细胞因子，IL-4 为 Th2 最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分 Thl 与 Th2。Thl 为 IFN-+ ，Th2 为 IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下 Th0 分化为 Thl 和 Th2 的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的 Thl 和 Th2 细胞，这时我们所能检测的胞内的 IFN-和 IL-4 也微乎其微。当 Th 细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中 Th0 即会向 Thl 或 Th2 大量分化，此时我们检测到的 IFN- 和 IL-4 也较多。本实验的检测实际上是检测 Th 细胞对刺激素刺激的反应能力。方 案 （ Prot
10、ocol）细胞周期检测1.细胞制备和染色: -收获细胞并 PBS 洗涤,10*4-6 个,染色过程之前要经过100-300 目滤网过滤,离心弃上清待用;-使用 BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒 (LPR:打孔固定溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入 LPR 100 ul,室温避光 20 MIN,再加入 DNA STAIN 1000 ul,室温避光 20 MIN,上机检测.-使用酒精固定和 PI: 上述细胞内加入 70%预冷酒精,4 C 过夜; 离心弃上清后加入 PI 工作液室温避光 30MIN.2.从 PROTOCOL 中找出 DNA CONTENTS
