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1、一、SDS 法基本原理是研磨的组织细胞用热的 SDS 裂解后，加入高浓度的 KAc，0放置以除去蛋白和多糖类杂质，最后用乙醇或异丙醇沉淀。1、 试剂(1)提取缓冲液Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）EDTA 50mmol/L （pH8.0）NaCl 500 mmol/L灭菌后加 -巯基乙醇至 10 mmol/L(2)裂解液 20%SDS(3)高盐溶液 5mol/L KAc(4) RNaseA 10mg/ml(5) 异丙醇(6)灭菌 ddH2O 或 TE2、 仪器离心机， 恒温水浴, 台式高速离心机，电泳装置3、实验程序（1） 、离心菌体，再用灭菌 ddH2O 冲洗 2 次，放入
2、经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有 500L 提取液的离心管中,轻轻混匀。（2） 、 向管中加入 50L20%SDS 溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组 DNA 断裂 ，65保温 10min，并不时摇动。（3） 、 加入 150L 5mol/L KAc，混匀，置冰上 20-30 min。（4） 、 4,15 000rpm 离心 15min,转移上清到另一离心管中，加入 0.7V 的异丙醇，混匀，-20沉淀 30 min 。（5） 、12 000rpm 离心 10min 回收基因组 DNA 沉淀，吹干后加入适量的灭菌 ddH2O 或 TE溶解 DNA
3、。（6） 、 加入 1/10 体积的 RNaseA，37保温 20min，除去 RNA。（7） 、 C：I 抽提后，加 2V 乙醇，-20 沉淀 30 min 。 12 000rpm 离心 10min 回收基因组DNA 沉淀。（8） 、 用 400L 70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌 ddH2 O 或 TE 溶解 DNA。（9） 、 电泳检测完整性。二、lysed cells directly by phenol（一） 、试剂：1、STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)2、TE buffer (10 mM
4、Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)（二） 、实验程序1、 。离心菌体2、400 l STE Buffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)洗 2 遍3、8000g for 2 min4、The pellets were resuspended in 200 ll TE buffer (10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)5、50 mg of 425600 m size-fractionated glass beads (Sigma) were added to the cell
5、suspension.6、100 l Tris-saturated phenol (pH 8.0) was added to these tubes, followed by a vortex-mixing step of 120200 s to lyse cells.7、13 000g for 5 min at 4 to separate the aqueous phase from the organic phase.8、160 l upper aqueous phase was transferred to a clean 1.5 ml tube.9、40 l TE buffer was
6、 added to make 200 l and mixed with 100 l chloroform10、centrifuged for 5 min at 13 000g at 4 11、Lysate was purified by chloroform extraction until a white interface was no longer present; this procedure might have to be repeated two to three times.12、160 l upper aqueous phase was transferred to a cl
7、ean 1.5 ml tube.13、40 ll TE and 5 l RNase (at 10 mg/ml) were added and incubated at 37 for 10 min to digest RNA.14、Then 100 l chloroform was added to the tube, mixed well and centrifuged for 5 min at 13000g at 4 .15、150 l upper aqueous phase was transferred to a clean 1.5 ml tube.16、The aqueous phas
8、e contained purified DNA and was directly used for the subsequent experiments or stored at -20 .三、蜗牛酶破壁法（一） 、试剂：1、500 L PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和 N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）2、蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12 用 0.22 m 细菌滤膜过滤除菌）3、裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，1
9、0 mmol/L T 、Tris-HCl，pH8.0, 1mmol /L EDTA）4、5mol/L KAc( pH 8.9)（二） 、实验程序1、离心菌体，沉淀中加入 500 L PBS（0.01 mo l/L N a2 HPO4 和 N aH2 PO4, pH7.0, 0.15 mol /L NaCl）重悬 , 12 000 r /m in 离心 2 m in; 弃上清, 重复悬浮一次2、沉淀溶于 100 L 含 20 mg /mL 的蜗牛酶溶液中（0.1 mo l/L 磷酸缓冲液, pH7.4, 0.25mo l/L MgC12 用 0.22 m 细菌滤膜过滤除菌）3、45 作用 2 h
10、4、加 100 L 裂解液（2% Triton X-100, 1 % SDS, 0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L T 、Tris-HCl，pH8.0, 1mmol /L EDTA）5、- 20 冷冻 , 然后室温震荡溶解, 反复 3 次6、向悬浮液中加入 150 L 5mol/L KAc( pH 8.9)轻轻混匀7、10 000 r/min 离心 5 min; 将上清转移到一新的 1.5 mL 离心管中8、乙醇沉淀四、改良 CTAB 法1、取 1.5 mL 菌液，12000rpm*2min ，MQ 洗 2 遍2、加入 500 L 5CTAB(含 1 -巯基乙醇), 液氮中速冷
11、30 s, 立即 65 30 s, 反复 3次3、加入 1/3 体积的玻璃珠, 漩涡振荡器上高速振荡 4 min5 min4、65 保温 20 min , 每隔 10 min 摇匀 1 次5、加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1,V/V/V), 12000 r/min 离心 10 min6、将上清液移入到新的离心管中, 加入等体积的氯仿: 异戊醇 (24:1,V/V), 12000 r/min 离心 10 min 。7、在上清中加入 2 倍体积预冷的无水乙醇,20静置 20 min30 min, 12000 r/min 离心 10 min。8、倒掉上清, 加 70的酒精 200 L 洗沉
12、淀,室温干燥9、加入 100 L TE 使 DNA 完全溶解10、加入 RNase A (10 mg/mL) , 65保温 30 min 以上11、重复 7-9，最后 DNA 溶于 30 L ddH2O 中。五、亚精胺对 DNA 进行纯化利用亚精胺对含多糖、多酚类物质较多的植物、真菌等材料的 DNA 进行纯化，以去除杂质，利于后续试验。1、加入 400lTris-HCl（100mM 8.0） ，溶解 DNA2、400l 亚精胺（5mM ）振荡3、4 ，放置 15 分钟4、4 ，17000g，离心 15 分钟，弃上清5、加 400l盐溶液（10mM MgCl2、300mM NaCl2） ，400
13、l 异丙醇，振荡，室温放置 15分钟。6、17 000g，离心 15 分钟7、70%乙醇，轻摇，洗涤8、晾干后溶解。六、TRIzol1、离心菌体，MQ 洗 2 遍2、液氮研磨3、加 1 ml TRIzol 每 5-10*106 Yeast cells，反复吹吸 4、15-30*5min5、0.2 ml 氯仿，混匀 15sec，然后 15-30*2-3 min6、12000g*15min at 4 7、去除水相8、0.3 ml 无水乙醇沉淀中间相和有机相，颠倒混匀，15-30*2-3 min9、2000g*5min at 410、去除苯酚-乙醇上清11、沉淀（含 DNA）用 1ml 洗液（0.1M 柠檬酸钠，10%乙醇）重悬，15-30 *30 min，定期混匀，2000g*5min at 4离心12、重复一次13、75%乙醇（1.5-2ml）重悬沉淀（DNA） ，15-30 *10-20min，2000g*5min at 4离心14、5-15min 烘干15、300-600 L 8 mM NaOH 溶解 DNA（终浓度 0.2-0.3g/L） ，16、HEPES 调节 PH 至 7-8，加 1mM EDTA，-20 保存。
