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1、酵母菌分批发酵试验一、实验目的1. 学习酵母菌的发酵方法及其发酵过程的优化控制技术；2. 学习和掌握分批发酵一般过程和操作规程。二、实验原理酿酒酵母是一种食品级的微生物，人类从几千年前就开始利用它了，像夏禹时期就有仪狄作酒的记载。干酵母蛋白质含量高达 45%，且其蛋白氨基酸品种齐全，维生素丰富，营养价值较高，是饲料工业、医药工业、发酵工业和食品工业的重要原料。早在 1900年时，面包酵母已经形成大生产的规模。作为人类食物的酵母生产，则是在第一次世界大战时在德国发展起来的。酵母单细胞蛋白一直是欧美市场上缺乏的蛋白质资源，国内也很匮乏。本实验在发酵工程课堂教学理论基础上，以分批发酵法制备酿酒酵母细
2、胞为实践内容，深入理解发酵原理、方法以及过程及其优化控制方法。通过实践与理论的结合，加深对发酵工程的认识，进一步增进专业能力和素养。发酵工程实验日程表序号 实验项目 时间 实验内容安排1培养基制备与灭菌预计4学时1、 固体培养基配制 500ml/组，分装 2瓶；2、 培养皿清洗及包扎 15副/组；无菌水 100ml/瓶；3、 吸管包扎 4支/组；4、 液体培养基制备：800ml/组，分装 16瓶，灭菌 0.1MPa,20min.2酵母菌种活化与种子制预计2学时1、菌种的分离纯化:超净工作台消毒（UV 照射 20min）75%乙醇擦拭台面；活性酵母菌粉无菌水溶解(稀释 10-2倍)涡旋震荡 5m
3、in；倒平板(10 副平皿/组)平板划线分离30倒置培养。2、接种准备工作：超净工作台消毒（UV 照射 20min）75%乙醇擦拭台面。1、 种子培养接种：平板单一菌落种子培养基（2 环/瓶）涡旋震荡 3-5min；2、 摇瓶培养：摇床设置及调节（30，200r/m）摇瓶固定启动培养。3发酵罐结构、操作规程及酵母菌分批发酵预计 8学时1、 发酵培养基配制：18L。2、 发酵罐操作培训：发酵罐初始状态检查及调节清洗（清水冲洗 2-3遍）发酵罐运行启动发酵罐运行参数设置空罐灭菌（0.15MPa,20min）进料实罐灭菌（0.1MPa 维持 30min）冷却火焰封口接种发酵参数稳定状态调节与维持。3
4、、 发酵取样：取样管灭菌取样再灭菌；4、 发酵中间过程分析（0 hour）： pH 测定（pH 计 or精密试纸）；酸度（中和法）；残糖测定（折光法）；菌体浓度测定（A 600光密度法）5、 中间取样：每间隔 4h, 取样管灭菌取样再灭菌.共计 4-6次 ；4酵母菌的形态观察；酵母细胞的分离提取预计 6学时1、 水浸片制作及观察2、 酵母菌分离条件试验3、 发酵结束工作：器皿、设备还原，环境清洁实验一 培养基制备与灭菌1、实验原理培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一个完整的培养基配方组成包括组成成分、各组成成分的浓度和合适的 pH。培
5、养基的组成成分主要有碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、生长因子以及特殊用途的前体和诱导物。实验利用葡萄糖、蛋白胨、酵母抽提物组成的培养基分批发酵培养酵母菌。灭菌是指从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子，或从中将其除去。绝大多数工业发酵是需氧的纯种发酵，因此所使用的培养基须彻底灭菌。本实验采用 121，30min 的湿热灭菌法来对培养基进行灭菌处理。2、仪器、材料和试剂（1）仪器电子天平；高压灭菌锅（2）材料蛋白胨；酵母抽提物；葡萄糖；去离子水；pH 试纸；NaOH；HCl；100mL 三角瓶；250mL 三角瓶；瓶塞；玻璃棒；称量纸；100mL 量筒；500mL 烧杯；培养皿（3）试剂
6、固体平板培养基：葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，酵母抽提物 1%，琼脂 2%。液体培养基：葡萄糖 2%，蛋白胨 2%，酵母抽提物 1%3、实验步骤（1）计算按固体培养基和液体培养基的配方，计算 500mL固体培养基和800mL液体培养基各物质的用量。（2）称药品用砝码天平准确称量各物质。（3）溶解将培养基的组分放加在 500mL烧杯的水中，玻璃棒搅拌溶解。（固体培养基琼脂在室温下不能溶解，需加热煮化）。（4）分装液体培养基每组按 50L 培养基/250mL 三角瓶规格分装 16瓶；固体培养基分装 250mL培养基/250mL 三角瓶。（5）包扎 三角瓶口塞上瓶塞后用牛皮纸和线绳包扎，以防灭菌时冷凝
7、水沾湿棉塞。在纸上写上培养基名称、组别、日期。（6）灭菌放置于高压蒸汽灭菌锅内，121湿热灭菌 30min。（7）倒平板待高压蒸汽灭菌锅降温至 60时，取出培养基，液体培养基室温放置，固体培养基在已紫外灭菌的超净工作台里倒制 5-10只平板。【实验注意事项】（1） 准确称量各物质，称完药品应及时盖紧瓶盖。（2） 调 pH值时要小心操作，避免回调。（3） 不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。（4） 灭菌操作中务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。实验二 酵母菌种活化与种子制备1、实验原理菌种活化是指将保存在砂土管、冷冻干燥管、冷冻斜面中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面或平板培养基进行复苏处理
8、。活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种。这些纯种培养物称为发酵的种子。种子的一般制备过程可用下图表示：2、仪器、材料和试剂（1）仪器恒温培养箱；超净工作台；恒温摇床（2）材料酿酒酵母菌种；接种环（3）试剂固体培养基；液体培养基3、实验步骤（1）超净工作台灭菌打开紫外灯，照射 30min，完毕后打开风机吹 5min。(2) 准备工作将酵母菌种和培养基平板放在超净工作台中，点燃酒精灯，用 75%的酒精棉球擦拭双手。(3) 灼烧接种环将接种环在酒精灯外焰上来回移动着灼烧，其中螺旋接头部分多烧一会儿，接种环烧至红热状态后，移离火焰冷却。(4) 划线法分离接种环挑取少量
9、酵母菌，左手拿培养基平板在酒精灯火焰旁打开，接种环在平板表面分三次作“之”字形划线。每次划线后要烧接种环，再从上一次划痕的尾部拉出后划下一区，依次划成 4个区。(5) 菌落培养将划线接种的平板倒置于 30培养箱中培养 24h。观察菌落的大小、颜色、形状。(6) 单菌落接种在超净工作台中（注意无菌操作），将 50mL培养基/250mL三角瓶的瓶口连同瓶塞在酒精灯火焰上旋转灼烧片刻后取下棉塞，用灼烧过的接种环挑取一个酵母单菌落，伸入液体培养基中振荡几下，取出在火焰上灼烧，再将瓶塞塞好。再依次完成另外三瓶 50mL培养基/250mL三角瓶的接种操作。(7) 标记在接种的三解瓶壁上贴上标签，注明菌种名
10、称、操作人、日期。(8) 种子培养将接种后的培养基置于 30摇床中，200rpm，振荡培养约12h。【实验注意事项】（1） 整个实验过程要严格无菌操作。（2） 标记时请写明操作者的姓名，方便查找和整理，提高效率。（3） 划线及接种完后要将接种环在火焰上灼烧，以杀死残留的酵母菌。实验三 发酵罐结构及使用操作规程1、实验目的熟悉发酵罐基本结构，了解发酵罐工作原理，学会发酵罐使用方法。2、实验内容（1）发酵罐基本结构组成：1) 罐体系统： 罐体、夹套、搅拌器、挡板、进料口、接种口、放料口、排气管、进气管、取样管、照明灯等。2) 灭菌系统：蒸汽发生器、蒸汽分配管、夹套加热装置、放料口灭菌装置、通气管取
11、样管灭菌装置、空气过滤系统灭菌装置。3) 温度控制系统：罐内温度传感器（电极）、水箱温度传感器（电极）、恒温水箱、恒温水循环管路。4) 无菌空气制备系统：空气压缩机、气液分离器、气体流量计、气流调节器、空气过滤器（2 级）。5) 控制系统：电源开关、操作显示屏、控制器触摸开关、参数设置转换调节屏。发酵罐外形图（2）发酵罐操作规程1）发酵罐工艺操作条件温度：2540。压力：00.3MPa(表压)。灭菌条件；温度100140，压力 00.3MPa (表压).pH：211。需氧量：0050.3 kmo1/m3h。通气量：0.32 V/V/M。功率消耗：0.54kW/m 3。发酵热量：5，00020，
12、000 kcalm 3 h。2）清洗工作清洗前应取出 pH、DO 电极。清洗罐内可配合进水、进气、电机搅拌、加温一起进行。清洗后安装要注意罐内密封圈、硅胶垫就位情况。注意罐与罐座间隙均衡。3）试车将电极、电机、电缆、进出气软管、冷凝器进出水接头安装就位；安装完毕后要对罐体内通气（0.2MPa）作密封性试验。方法如下：关闭 阀门；旋紧罐体上每一个接口、堵头、电极紧固帽；打开空压机，调节气阀，使罐压保持 0.2MPa左右；对系统进行 2-3小时试运行，如有问题作相应处理后，方可正式使用。 4）发酵罐使用操作规程如果短期内需再次培养发酵，应对其进行 2-3次清水清洗待用。如准备长期停用，则应对其进行
13、灭菌，然后放去水箱与罐内存水，放松罐盖紧固螺丝，取出电极保养储存好，将罐、各管道余水放净，关闭所有阀门，电源，盖上防尘罩。发酵罐操作开始前，先关闭所有出料口、取样口、进气口，打开出气阀；加入发酵培养基，装注完成后旋紧进料口螺盖。灭菌：启动蒸汽发生器，待气压达到 0.2Mpa以上时：a.开启发酵罐出气阀，开启高压蒸汽阀将高压蒸汽通过进气阀引入夹套，打开夹套排水阀，排除蒸汽冷凝水，控制阀门开量，保持微弱出汽；b.同时通过蒸汽分配管将蒸汽引入空气过滤系统（注意：蒸汽引入前关闭通向电器控制柜的空气阀门），使蒸汽通过一级和二级空气过滤器并顺利进入取样口出口，保持取样放出口微弱出汽；c.另一路蒸汽通过蒸汽
14、阀发酵罐放料口，并保持放料口微弱出汽；d.等到罐内培养基温度达到 80时，开启与罐直接相连的通气阀，将高压蒸汽直接接入罐内加热培养基，并对与罐相连的管道灭菌。e.直到罐内培养基开始沸腾后，关闭排气阀，使罐内升压至 0.1Mpa（或灭菌温度 121），维持温度 0.5-1.0小时。关闭蒸汽进气阀，开启冷却水管路系统，通过夹套冷却发酵培养基，当罐内压力接近常压前向罐内通入无菌空气，保持罐内空气压力 0.03MPa上下，至发酵温度关闭冷却水系统。启动空气压缩机，开启进气阀、使压缩空气通过旋风分离器及空气过滤器，从进气阀进入发酵罐，使溶解氧浓度达到发酵初始水平。接种：接种方法可采用火焰接种法或差压接种
15、法。 a.火焰接种法：在接种口用酒精火圈消毒，然后打开接种口盖，迅速将接种液倒入罐内，在把盖拧紧。b. 差压法：在灭菌前放入垫片，接种时把接种口盖打开，先倒入一定量的酒精消毒。待片刻后把种液瓶的针头插入接种口的垫片。利用罐内压力和种液瓶内的压力差，将种液引入罐内，拧紧盖子。 发酵状态调节a.罐压：发酵过程中须手动控制罐压，即用出口阀控制罐内压力。调节空气流量的，须同时调节出口阀，应保持罐内压力恒定大于 0.03Mpa。 b. 溶解氧（DO）的测量和控制 溶解氧的标定：在接种前，在恒定的发酵温度下，将转速及空气量开到最大值时的溶解氧 DO值作为 100%。发酵过程的溶解氧 DO测量和控制：DO 的控制可采用调节空气流量和调节转速来达到。最简单是转速和溶氧的关联控制。其次则必须同时调节进气量（手动）控制。有时需要通入纯氧（如在某些基因工程菌的高密度培养中）才能达到要求的 DO值。c.pH 的测量与控制pH值的校正：在灭菌前应对 pH电极进行 PH值的校正。在发酵过程中 PH值的控制使用蠕动泵的加酸加碱来达到的，酸瓶或碱瓶须先在灭菌锅中灭菌。旋松进料口螺旋盖，在进料口环槽中加入适量酒精棉，点燃酒精，打开进料口螺旋盖，将种子三角瓶菌液接入发酵罐。搅拌均匀后，开始发酵控制。d.间隔 8 h，开启取样阀取样 30050
