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1、山柰素与熊果苷作用正常黑素细胞分子机制的对比研究商进 1，辛燕 2，冯红霞 2，王震宇 1(1.包头医学院第一附属医院皮肤科；2. 内蒙古包钢医院-内蒙古医学院第三临床医学院)摘要 目的：比较山柰素与熊果苷对人正常黑素细胞增殖、黑素合成及其酪氨酸酶活性的影响，为探索色素沉着性皮肤病的发病机制以及筛选新的治疗药物提供理论依据。方法：以不同浓度(10-100mol/l)山柰素与熊果苷干预培养的人正常黑色素细胞，检测两者对黑素细胞的黑素含量、细胞增殖及其酪氨酸酶活性的影响。 结果：对于黑素细胞酪氨酸酶活性和黑素含量的抑制作用，山柰素在各个浓度均优于熊果苷，并有显著性差异(P0.05)，山柰素在对细胞
2、增殖抑制率无明显影响，而熊果苷在各浓度对细胞增殖抑制作用显著，且随其浓度增加，抑制率逐渐增强。结论：山柰素对黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的抑制作用强于熊果苷，并对黑素细胞的增殖及形态无明显的负面影响，是一种有良好应用前景的酪氨酸酶抑制剂。关键词： 人正常黑素细胞 山柰素 熊果苷Kaempferol and Arbutin on tyrosinase activity , melanin synthesis and proliferation of melanocytesShangjin,Xinyan,Fenghongxia,Wangzhenyu(1.Department of Dermato
3、logy, Third Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, China；2.Department of Dermatology, Third Affiliated Hospital of Inner Mongolian Medical College, Baotou 014010, China )ABSTRACT Objective To get the molecular mechanism involved in kaemferol-induced tyrosinase activity of huma
4、n normal cultured melanocytes. Method Human normal melanocytes have been cultivated successfully, then study the effects of various concentration of kaempferol and Arbutin upon proliferation, melanin synthesis and tyrosinase activity in melanocytes. Result Tyrosinase activity and melanin content of
5、melanocyte are obviously inhibited by kaempferol of 10-100mol/l concentrations. Conclusions Kaempferol on inhibition of tyrosinase activity and melanin content of melanocyte than arbutin. Key word: Human Normal Melanocyte, Kaempferol, Arbutin作者单位：014010 包头 内蒙古包钢医院-内蒙古医学院第三临床医学院 通讯作者：辛燕，email:黄褐斑是一种临
6、床常见的色素沉着性皮肤病,多见于东方中、青年女性，不仅影响容貌，还给患者带来诸多心理、生活方面的烦恼和痛苦，因其发病机理尚未完全阐明，目前的治疗仍是困扰皮肤科医生的难题之一 1 ，熊果苷是国际上公认的黑素合成抑制剂和应用很广的美白剂 2，山柰素（KPF）是对黑素细胞(MC)的酪氨酸酶(TYR)活性有明显的抑制作用，而且在高浓度时细胞长势良好 3。我们用熊果苷与山奈素进行对比研究，目的是研究山奈素的作用是否优于熊果苷。同时观察二者对 MC 增殖及黑素合成、TYR 活性的影响之不同。1.材料与方法1.1 材 料IBMX，佛波酯(TPA)，霍乱毒素(CT)，二甲基亚砜(DMSO)，左旋多巴(L-Do
7、pa)，噻唑蓝(MTT)，KPF，熊果苷(Arbutin)均购自美国 Sigma 公司。DMEM/ HamF12 培养基(1:1)购自美国 Gibco 公司。L-谷氨酰胺(L-Glu)，胰蛋白酶(trypsin)(1 ：250)，EDTA，TritonX-100 溶液均购自美国 Amresco 公司。胎牛血清(特级)购自杭州四季青公司。青霉素、链霉素购自山东鲁南制药公司1.2 实验方法：1.2.1 细胞培养：参照辛燕 3等的方法，采用 DMEMHamF-12 培养基（1:1）,添加10 % 新生牛血清,6. 8 mM L - 谷氨酰胺,50ngPmL TPA ,210ngPmL CT ,0.
8、1 mM IBMX ,青霉素 100IUPmL 及链霉素 0. 1 mgPmL。标本均来源于内蒙古医学院三附院-内蒙古包钢医院泌尿外科知情同意地包皮环切术者包皮，年龄 13-20 岁。0.25 %的胰酶溶液,置 4 冰箱中消化 1620h。制成单细胞悬液培养。传代时在培养基中加入 100gPmL 的基因素,作用3 d ,便可将成纤维细胞清除。取传 2、3 代细胞,融合 80 %以上时的 MC 用于实验,用含0.02 %EDTA 的 0.25 %胰酶溶液消化细胞 ,MC 以 8103 细胞/孔的密度接种到 96 孔培养板中,每孔培养基 200L 。1.2.2 药物处理及实验分组：山柰素、熊果苷
9、DMSO 新鲜配制，其浓度均为 0.1mol/l,避光保存在-20冰箱 2 周内使用，临用时用新鲜培养基调至终浓度。 实验设定山柰素与熊果苷的终浓度分别为 1、5、10、25、50、75、100mol/l。实验分组：山柰素、熊果苷组，空白对照组（细胞无药组） 。1.2.3 TYR 活性测定 4：冰 PBS 液洗涤 2 次，每孔加入 1%的 TritonX-100 溶液50l，迅速置于-80 。 C 冰箱冻存 30min。在室温融化，加入 10mmol/l 的 L-Dopa 溶液50l，置 37。 C 水浴中反应 2h； 于 490nm 波长处比色，经空白孔调零，测各孔吸光度值，用 L-Dopa
10、 的自动氧化校正。测试药物每一浓度设置 3 个复孔，取平均值。以不加测试药物体外培养的 MC 和只加 2.5DMSO 的细胞孔作为空白对照。TYR 活性用每个加药处理组 A490占空白对照组 A490值的百分率表示。1.2.4 黑素含量的测定 5：黑素含量采用 Virador 等的方法测定。收集约 107细胞，加入 1mol 的 NaOH； 放于 80。 C 水浴反应 30min，再加入去离子水，使 NaOH 浓度调节为0.2mol；吸打均匀后，移入 96 孔板，每个浓度 3 个复孔；空白对照组共设 3 个复孔。选择490nm 波长在酶标仪上测光吸收值，以空白孔调零；黑素含量用每个加药处理组
11、A490占空白对照组 A490值的百分率表示。1.2.5 黑素细胞增殖的测定：采用 MTT 法 6，在终止培养前 4h 每孔加入 5mg/ml MTT溶液 20l，37 。 C 继续孵育 4h；弃上清液，每孔加入 150l DMSO，振荡 10min；选择490nm 波长在酶标仪上测光吸收值，以空白孔调零。测试药物每一浓度设置 3 个复孔，取平均值。以不加测试药物体外培养的 MC 和只加 2.5DMSO 的细胞孔作为空白对照；黑素增殖抑制率活性用(1-每个加药处理组 A490)/空白对照组 A490*100%表示。1.2.6 统计学分析：统计分析过程使用 SPSS13.0 统计软件，所采集的实
12、验数据均以平均数标准差表示。山柰素组与熊果苷、空白对照组间的均数比较采用多元方差分析。P0.05 被认为有统计学意义。2.结果：2.1 KPF 与熊果苷对 TYR 活性的影响：KPF 对 TYR 活性有抑制作用，呈明显的量效和时效关系，随着 KPF 浓度的升高，对 TYR 的活性抑制率逐渐增强，随着作用时间的延长，相同浓度的 KPF 对 TYR 活性的抑制作用也加强。熊果苷对 TYR 并无明显影响，也无量效-时效的关系，在各浓度与 KPF 组比较均有显著性差异(P0.05)，特别是在 72h，100moL 时这种差异最为显著(P0.01)。(表 1)。表 1：KPF +IBMX 与熊果苷+IB
13、MX 及 IBMX 在 72h 对 TYR 的影响浓度(moL) 药 物 分 组 均数标准差(%) F P10 山柰素 65.001.082 熊果苷 66.000.964 1.777 0.04825 山柰素 73.330.462 熊果苷 85.000.655 2.862 0.04350 山柰素 66.000.360 熊果苷 95.331.006 8.269 0.00875 山柰素 60.000.608 熊果苷 93.330.568 11.948 0.003100 山柰素 53.670.450 熊果苷 89.330.378 16.480 0.001（注：代表 P0.05，代表 P0.01）2.3
14、 KPF 与熊果苷对黑素合成的影响：KPF 对黑素含量有抑制作用，呈明显的量效-时效关系，随着 KPF 浓度的升高，对黑素含量的抑制逐渐增强，随着作用时间的延长，相同浓度的 KPF 对黑素含量的抑制作用也加强。熊果苷组对黑素含量也有抑制作用，也呈现量效和时效关系，但熊果苷对黑素含量的抑制强度明显低于山柰素实验组，经统计学分析后p0.05，且这种差异在两组 100moL 时作用 48h 最为明显 p0.01（图 1） 。山 柰 素 与 熊 果 苷 在 48h对 黑 素 含 量 的 抑 制00.20.40.60.811.210 25 50 75 10加 药 浓 度 (umol)黑素含量(实验组A4
15、90/空白组A490) 山 柰 素熊 果 苷图 1：KPF 与熊果苷在 48h 对黑素含量的影响2.4 KPF 与熊果苷对 MC 增殖的影响： KPF 对 MC 的增殖抑制率无明显影响。在不同时间、不同浓度的 KPF 对 MC 的增殖抑制均较小，细胞长势良好，且略有促增殖作用，在作用48h 1、5、10moL 时这种促增殖作用呈上长趋势，以后逐渐减弱。与熊果苷组比较，熊果苷对 MC 增殖的抑制作用非常明显，并呈现量效-时效关系，随着浓度增加抑制作用逐渐增强，在 100moL 时抑制作用最强，经统计学方差分析 KPF 组与熊果苷组在各浓度均有显著性差异（图 2） 。山 柰 素 与 熊 果 苷 在 48h对 MC增 殖 的 影 响0.9286 0.8295 0.70210.582 0.576149 0.9659 0.9706 0.918 0.967400.20.40.
