《食品发酵实验讲义》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食品发酵实验讲义（13页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1实验一淀粉酶的制备一、实验目的学习并掌握 淀粉酶的制备工艺。二、实验原理淀粉酶广泛存在于植物、哺乳动物和微生物中。淀粉酶是内切酶，酶的作用点仅限于淀粉链的 1，4 糖苷键，对 1，6 糖苷键不能作用，但能越过 1，6 糖苷键，将 1，4 糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐变红棕色。在酶解的最初阶段，淀粉酶对淀粉的水解速度很快，但当水解到一定程度后，水解虽在继续进行，水解速度却变得缓慢。该酶的最小作用底物是麦芽三糖以上的低聚糖，对麦芽三糖的作用很弱，对麦芽糖没有水解能力。枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一
2、，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本实验利用高产 淀粉酶的枯草芽孢杆菌 T2 生产 淀粉酶用于制备淀粉水解糖。三、实验器材1.菌种：枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）T22.仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨 5g，酵母膏 2.5g，葡萄糖 0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH 2PO4 1g，MgSO 4.7H2O 0.25g，CaCl 2.2H2O 0.1g，H 2O 500mL，pH7.0。分装于 100mL 锥形瓶中，每瓶 50mL，121灭菌 20min。2.接种与产酶培养接种环灼
3、烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。37振荡培养 48 h。3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中 10000r/min 离心 10 min，除菌体，上清液即为 淀粉酶粗酶液。2实验二糖化酶的制备一、 实验目的学习并掌握黑曲霉发酵产生糖化酶的基本原理及操作方法。二、实验原理糖化酶又称葡萄糖淀粉酶 (glucoamylase, EC 3.2.1.3)，其作用方式不像 -淀粉酶那样无作用次序,而是从底物链的非还原性末端开始,顺次切下一个个葡萄糖单位,遇到分支处的 -1,6 糖苷键时,可将 -1,6 糖苷键切开,然后继
4、续作用 -1,4 糖苷键,直到产物全部成为葡萄糖为止。但糖化酶对 -1,6 糖苷键的作用速度远不及对 -1,4 糖苷键的作用速度，因此水解支链淀粉多的淀粉时，需延长水解作用时间或添加部分支链淀粉酶。 我国糖化酶的生产主要由黑曲霉优良菌种经深层发酵精制提炼而成。本实验利用黑曲霉具有多种活力较强酶系的特点，利用淀粉类物质为原料，获得制备淀粉水解糖所需的糖化酶。三、实验材料1. 菌种：黑曲霉（ Aspergillus niger）2. 仪器：洁净工作台、灭菌锅、振荡培养箱、高速冷冻离心机、高压灭菌锅四、实验步骤实验流程：保藏菌种菌株活化及平板扩大培养 摇瓶培养1.菌株活化及扩大培养制备 PDA 培养
5、基：去皮马铃薯 200 g 切成小块，加水约 500 mL，煮沸 30 min，然后用纱布过滤，滤液加蔗糖 20 g，琼脂 20 g。溶化后加水定容至 1000 mL，分装于 250 ml 锥形瓶中，121灭菌 20 min，自然 pH。接种：取灭菌后 PDA 培养基倒平板，冷却后，接种斜面保藏的黑曲霉（ Aspergillus niger）菌种，28恒温培养 3d。 2.摇瓶发酵培养 发酵培养基的制备：玉米粉培养基：玉米粉 30g,米糠 5g,麸皮 5g,加水 1000ml,拌匀至无干粉又无结团，分装于 250 ml 锥形瓶内，每瓶 100 ml, 自然 pH，121灭菌 20 min。接种
6、与产酶培养:取培养 72h 的黑曲霉平板，用打孔器打孔制成菌片。每个锥形瓶中接种 12 片，28振荡培养 96 h。3.离心3将摇床培养 4d 的黑曲霉发酵液 4 层纱布过滤后离心（10000r/min，10min）除菌体，所得上清液即为糖化酶粗酶液。实验三 糖化酶活力测定一、实验目的1. 掌握糖化酶酶活定义及其计算方法。酶活定义：将 1g 固体酶粉（或 1ml 液体酶） ，于 40、pH4.6 的条件下，1 h 分解可溶性淀粉产生 1mg 葡萄糖所需的酶量定义为 1 个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。2. 掌握糖化酶的测定方法及原理。二、实验原理糖化酶是一种外切型糖苷酶，可从淀粉分子的
7、非还原性末端依次水解-1，4-糖苷键生成葡萄糖。本实验根据3，5二硝基水杨酸(DNS)与葡萄糖共热后被还原成棕红色的3氨基5硝基水杨酸在波长540nm处有较强光吸收且吸光度值与葡萄糖量呈正比的原理，利用分光光度计测定显色反应的吸光度值并根据吸光度值与葡萄糖含量的相互关系（见附图）确定糖化酶活力。附图：葡萄糖标准曲线三、实验材料1.仪器：恒温水浴锅、分光光度计、秒表、比色管、玻璃仪器等2.酶液：实验二所得粗酶液43.试剂（1）0.2 mol/L pH 4.5 醋酸缓冲液：称取 16.4 g 无水醋酸钠，溶解并定容至 1000 mL(A 液)。取分析纯冰醋酸 11.6 mL 定容至 1000 mL
8、（B 液） 。分别取 A液 25.5 mL，B 液 25.5 mL 混合,加 50 mL 蒸馏水。（2）1mo1/L NaOH 溶液:称取 40 g NaOH 加蒸馏水溶解，定容至 1000 ml。（3）1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠 100 g 溶于 400 mL 蒸馏水，加热中依次加入 NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸 5 g，苯酚 1 g，亚硫酸钠 0.25 g，搅拌至溶。冷却后定容至 500 mL，储于棕色瓶室温保存。（4）2可溶性淀粉溶液：准确称取 2 g 可溶性淀粉(预先于 100105烘干约 2 h)，加少量蒸馏水调匀，倾入 80 mL 左右的沸蒸馏水
9、中，继续煮沸至透明，冷却后定容至 100 mL。四、实验步骤于甲、乙两支 50 mL 比色管中，分别加入 2可溶性淀粉 25 mL 及0.2mol/L 醋酸缓冲液 5 mL，摇匀后置 40恒温水浴中预热 510min。在甲管中加入待测酶液 2 mL，乙管中加 2 mL 蒸馏水作对照，摇匀，立即记时，准确反应 30 min。取出试管，各加 1 mo1/L NaOH 溶液 0.2 mL 终止酶反应，冷却至室温。吸取上述反应液与空白液各 2.5 mL 于 25 mL 比色管中，用蒸馏水定容至刻度。分别吸取稀释液 2 mL 于试管中，加入 2 mL DNS，共同沸水浴 3min，冷却至室温后测定 54
10、0nm 处的光吸收值。比色时空白液用于调零。五、实验结果根据下式计算出发酵液的酶活大小XAB32.2 n221式中X糖化酶活力（u/mL）A根据 OD 值查出的葡萄糖量B吸取稀释后糖化液 2 mL，换算为 1 mL，即 1/21/2吸取酶液 2 mL，换算为 1 mLn糖化液稀释倍数（ 10）2反应 30 min，换算成 1h32.2反应液的总体积（mL）5实验四淀粉水解糖的制备一、实验目的学习并掌握淀粉水解糖的酶法制备工艺。二、实验原理根据淀粉的性质及采用的水解催化剂的不同，可将淀粉的水解方法分为酸解法、酸酶结合法和酶解法。酶解法是指利用淀粉酶将淀粉水解为葡萄糖的过程。酶解法制葡萄糖可分为两
11、步，第一步是利用 淀粉酶将淀粉液化为糊精及低聚糖，使淀粉的可溶性增加，这个过程称为液化；第二步是利用糖化酶将糊精或低聚糖进一步水解，转变为葡萄糖的过程，在生产上称为糖化。淀粉的液化和糖化都是在酶的作用下进行的，故也称为双酶水解法。酶解法制葡萄糖的优点有：（1）酶水解过程条件比较温和，不需耐高温、高压和耐酸的设备，便于就地取材。 （2）由于酶具有专一性，水解副反应少，所得糖液纯度高，淀粉的转化率高。 （3）可在较高淀粉乳浓度下水解。酸解法一般使用 1012B（含淀粉 18%20%） ；酶解法用 2023B（含淀粉34%40%） ，而且可以采用粗原料。 （4）用酶解法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦
12、味、质量高，有利于糖液的精制。三、实验材料1.材料：可溶性淀粉淀粉酶糖化酶CaCl 22.仪器：恒温水浴锅四、实验步骤1.淀粉的液化称取淀粉 2 g，加水至 100 mL，滴加 NaOH 调节 pH 为 6.06.5，加 0.11g CaCl2使 Ca2 浓度达到 0.01mol/L，加入 50 mL 实验一中枯草芽孢杆菌 T2 产生的 淀粉酶粗酶液，在 8590下保温 30min，碘液检测显棕色时，迅速升温至 100，加热 5min 使 淀粉酶失活，即可转入糖化阶段。2.淀粉的糖化将上述液化液降温至 60，调整 pH 为 4.04.5，按 100u/g 淀粉的量加入实验二中黑曲霉产生的糖化酶
13、粗酶液，保温 48h 左右，分别在0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、6h、12h、24h、48h 取反应液加入碘液 5ml，观察颜色变化。6五、实验结果接近碘液颜色时表明糖化完毕。实验五柠檬酸的发酵与结晶一、实验目的掌握用液体发酵法生产柠檬酸及用钙盐法获得柠檬酸结晶的方法。二、实验原理以淀粉质为原料发酵生产柠檬酸的微生物，都需要先将淀粉分解成葡萄糖，然后再进一步由葡萄糖生成柠檬酸。由于黑曲霉自身能产生液化酶和糖化酶，且糖化酶活力较高，故柠檬酸生产的糖化、发酵是由黑曲霉（ Aspergillus niger）一个菌株完成的，即黑曲霉可以边长菌、边糖化、边发酵产酸的方式生产柠檬酸。发
14、酵前期我们利用了黑曲霉产生的糖化酶来制备淀粉水解糖（实验二） ，本实验利用钙盐法从后期黑曲霉柠檬酸发酵液中分离提取并获得柠檬酸的结晶。钙盐法结晶柠檬酸的主要原理是，在除杂后的发酵液中加钙盐生成柠檬酸钙沉淀，达到与其它可溶性杂质分开的目的；然后在柠檬酸钙中加入硫酸酸解，生成柠檬酸和硫酸钙沉淀，浓缩除去硫酸钙沉淀后的柠檬酸溶液即得柠檬酸结晶。主要反应式为：2C 6H 8O 7H 2O+3CaCO3Ca3(C6H 5O 7)24H2O+3CO 2+H 2OCa3(C6H 5O 7) 24H 2O+3H2SO4+4H 2O2C6H 8O7H2O+3CaSO42H2OCaCO3+H2SO4 CaSO4+
15、H 2O+CO2附录：1.根据柠檬酸的生成量，由上面反应式可计算出中和柠檬酸所需 CaCO3的量（每中和 C6H 8O7H 2O 100 g 需要 CaCO3 71.5 g）及酸解时加入 H2SO4的量（每加入 1g CaCO3需要 H2SO4 0.98 g） 。2.柠檬酸含量的测定：吸取 1 mL 除杂后的上清液，加入到 100 mL 锥形瓶中，再加适量的去离子水，加 23 滴 1酚酞试剂，用 0.1429 molL NaOH 进行滴定至微红色，计算用去的 NaOH 体积，记为柠檬酸的百分含量（每消耗1mLNaOH 为 1%的酸度，即每 100 ml 柠檬酸溶液中所含柠檬酸的质量为 1g）
16、，用柠檬酸的百分含量乘以发酵液的体积即柠檬酸的含量。三、实验材料71.仪器：恒温水浴锅，鼓风干燥箱，离心机 2.发酵液：实验二中摇床培养 4d 的黑曲霉发酵液3.试剂：CaCO 3 ，1酚酞试剂硫酸溶液（1 molL H 2SO4）氢氧化钠溶液（NaOH，0.1429 molL）四、实验流程柠檬酸发酵液离心去除菌体及残渣 CaCO3中和上清液 离心得柠檬酸钙沉淀H 2SO4酸解 离心除硫酸钙沉淀 浓缩含柠檬酸的上清液柠檬酸结晶五、实验步骤1.除杂：将实验二所得粗酶液加热至 80保温 30 min，离心（4000r/min，10min）取上清，用酸碱滴定法测上清液中柠檬酸含量（方法见上附录） 。2CaCO 3中和沉淀：根据柠檬酸的含量计算出 CaCO3
